معلومة

البلازميد مع ITPG و pBR322 ori

البلازميد مع ITPG و pBR322 ori


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أبحث عن اقتراحات لأن عمليات البحث الخاصة بي على الإنترنت لا تظهر كثيرًا.

أحاول العثور على بلازميد له أصل pBR322 ، لأنه رقم نسخة منخفض (ish) ويمكنه تحمل إدخالات كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، أحتاج إلى أن يكون البلازميد محفزًا مع نظام آخر غير إعداد pBAD (على سبيل المثال ، سيكون IPTG جيدًا ، ولكن إذا كان هناك نظام مكبوت بشدة ، فسيكون ذلك أفضل لأن IPTG متسرب).

أخيرًا ، يمكنني أن أفعل ذلك بوجود شريط مقاومة يحتمل أن يكون غامضًا ، لكن هذه مشكلة أقل.

نقدر أي مساعدة.


عائلة ناقلات الحيوانات الأليفة هي ما تبحث عنه.


دور بروتين الحمض النووي أثناء تكرار pBR322 البلازميد في الإشريكية القولونية

تم التحقيق في الدور الحي لبروتين الإشريكية القولونية DnaA في تكرار البلازميد pBR322 ، باستخدام مشتق البلازميد الذي يحمل جين dnaA + المحرض. في وسط LB بدون محفز ، تم تثبيط تكاثر هذا البلازميد ، مثل pBR322 ، عن طريق تثبيط الحرارة لبروتين DnaA46 الكروموسومي بحيث توقف تراكم البلازميد من ساعة إلى ساعتين بعد تحول درجة الحرارة. لم يحدث هذا التثبيط عندما تم التعبير عن جين البلازميد dnaA + في وجود محفز isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside (IPTG). كما لم يلاحظ التثبيط في وسط الجلسرين الأدنى أو في وجود تركيزات منخفضة من الريفامبيسين أو الكلورامفينيكول. لم يؤثر حذف موقع ربط الحمض النووي الريبي (DnaA) ومواقع التجميع الأولي (pas ، rri) المصب لأصل النسخ المتماثل على رقم نسخة البلازميد أثناء النمو الأسي عند 30 درجة مئوية ، أو بعد تعطيل DnaA عن طريق التحول إلى 42 درجة مئوية في مضيف dnaA46 ، أو بعد زيادة العرض من DnaA ، مما يشير إلى أن هذه المواقع ليست متورطة في خطوة تحديد معدل النسخ المتماثل في الجسم الحي. كان تراكم مثبط التكرار ، RNAI ، مستقلاً عن نشاط DnaA ، مستبعدًا احتمال أن يعمل DnaA كمثبط لتوليف RNAI ، كما تم اقتراحه في الأدبيات. يمكن حل التغييرات في معدل تكرار البلازميد استجابة للتغيرات في نشاط DnaA (في وسط LB) إلى مكون مبكر ، يعتمد على rom ، ومتأخر ، مستقل عن rom. تظهر اللازميدات فقط التأثير المتأخر. بعد التعطيل الحراري لـ DnaC ، توقف تكاثر البلازميد على الفور (الملخص مقطوع عند 250 كلمة)


ناقل البروتين المؤتلف البكتيرية PET

نظام ناقل PET هو نظام قوي ومستخدم على نطاق واسع للتعبير عن البروتينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية. يتم استنساخ الجين محل الاهتمام في ناقل PET تحت سيطرة النظام التنظيمي للنسخ والترجمة من البكتيريا القوية T7. يتم تفعيل التعبير عن طريق توفير بوليميريز T7 RNA داخل الخلية. عندما يتم تحفيز النظام بالكامل ، يتم تخصيص جميع موارد الخلايا و rsquos تقريبًا للتعبير عن الجين المطلوب. مع بضع ساعات من التحريض ، يمكن أن يشتمل البروتين المؤتلف على ما يقرب من نصف البروتين الكلي للخلية و rsquos.

لمزيد من المعلومات حول نظام المتجهات هذا ، يرجى الرجوع إلى الأوراق أدناه.

مراجع عنوان
طرق الانزيم. 185: 60-89 (1990) استخدام بوليميراز T7 RNA لتوجيه التعبير عن الجينات المستنسخة.
J مول بيول. 219: 45 (1991) تطوير نظام المروج T7lac.

يسلط الضوء

يتم في البداية استنساخ الجين المعني في ناقل pET في مضيف بكتيريا يفتقر إلى جين T7 RNA polymerase. هذا يزيل عدم استقرار البلازميد بسبب التعبير عن البروتينات التي قد تكون ضارة بالخلايا المضيفة. بعد ذلك ، يمكن البدء في التعبير عن الجين محل الاهتمام بطريقتين محتملتين. يمكن أن تصاب الخلايا المضيفة بالعاثية التي تحمل جين بوليميريز T7 RNA (على سبيل المثال & lambdaCE6) ، أو بشكل أكثر شيوعًا ، يمكن نقل بلازميد PET إلى سلالة مضيفة للبكتيريا تم تصميم جينومها لتحمل جين بوليميريز T7 RNA تحت السيطرة المروج theLacUV5. يتم تحفيز التعبير عن بوليميراز T7 عن طريق إضافة IPTG التناظرية من اللاكتوز إلى الثقافة البكتيرية.

يوجد ناقل pET على هيئة بلازميد ذي رقم نسخة منخفض في المضيف E. coli ، مما يقلل من التعبير المتسرب قبل الحث. يستخدم المتجه نظام المروج T7lac للتعبير الجيني القوي والمسيطر عليه بإحكام. في هذا النظام ، يوجد محفز T7 يمكن أن يعمل عليه بوليميريز T7 RNA لدفع تعبير عالي المستوى عن الجين محل الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تسلسل مشغل lac (LacO) في اتجاه مجرى مروج T7 الذي يمكن أن يعمل عليه بروتين مثبط lac (LacI) لمنع نسخ مروج T7. يحمل البلازميد أيضًا المحفز الطبيعي وتسلسل الترميز لـ LacI. يعمل بروتين LacI في محفز LacUV5 في الخلايا المضيفة لقمع التعبير عن جين بوليميريز T7 RNA بواسطة بوليميراز المضيف ، ويعمل أيضًا في محفز T7lac على ناقل pET لمنع نسخ الجين محل الاهتمام بواسطة أي بوليميريز T7 RNA التي قد تكون بسبب التعبير المتسرب. تؤدي إضافة IPTG إلى منع العمل المثبط لـ LacI ، وبالتالي تحفيز التعبير عن بوليميريز T7 RNA وأيضًا إزالة تثبيط LacI للجين المعني.

على الرغم من أن نظام التعبير pET مصمم لتعبير البروتين المؤتلف عالي المستوى ، يمكن تقليل مستوى التعبير عن طريق تقليل كمية IPTG المتوفرة للخلايا المضيفة. يمكن أن يكون هذا مفيدًا عند التعبير عن البروتينات ذات القابلية المحدودة للذوبان. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النظام قادر على الحفاظ على الجين المعني في حالة صامتة نسخًا عندما لا يكون بوليميريز T7 RNA موجودًا.

سيتم توفير جميع ناقلات pET المخصصة في سلالة E. coli المصممة لتعظيم سلامة البلازميد وتفتقر إلى جين T7 RNA polymerase (مثل Stbl3). لإنتاج البروتين المؤتلف ، نوصي بنقل الناقل إلى سلالات البكتيريا المضيفة BL21 (DE3) أو HMS174 (DE3) ، والتي تحمل نسخًا كروموسومية من جين بوليميريز T7 RNA مدفوعًا بمحفز LacUV5. في الحالات التي تكون فيها سمية الجين المعني مشكلة في سلالات مضيف التعبير هذه ، قد يكون استخدام العوائل الحاملة للبلازميدات pLysS أو pLysE مفيدًا. تقوم هذه البلازميدات بقمع التعبير الأساسي للجين المعني عن طريق إنتاج الليزوزيم T7 ، مثبط بوليميريز T7 RNA.

مزايا

تعبير قوي: يسمح نظام تنظيم النسخ والترجمة T7 بإنتاج عالي المستوى جدًا للبروتينات ذات الأهمية ، في كثير من الحالات ما يقرب من 50 ٪ من إجمالي البروتين في الثقافة.

تعبير محكوم بإحكام: بشكل عام ، يتم قمع التعبير عن الجين محل الاهتمام بشدة في غياب IPTG المضافة ، وهذه الحالة & ldquooff & rdquo قوية جدًا لمعظم الجينات ذات الأهمية في معظم سلالات المضيف.

سلبيات

متطلبات المضيف: يجب الحفاظ على نواقل pET المكتملة في سلالة E. coli التي تفتقر إلى جين T7 RNA polymerase ، ويجب نقلها إلى سلالة مضيفة منفصلة تحتوي على جين T7 RNA polymerase قبل تحريض تعبير البروتين.

تعبير تسريب محتمل في بعض الأجهزة المضيفة: حتى في حالة عدم وجود IPTG ، قد يكون هناك تعبير منخفض المستوى عن بوليميريز T7 RNA من مروج LacUV5 في بعض سلالات مضيف التعبير ، مما قد يؤدي إلى سمية بكتيرية لجينات معينة ذات أهمية في سلالات مضيفة معينة.

المكونات الرئيسية

مروج T7: يؤدي إلى نسخ عالي المستوى للجين محل الاهتمام عند وجود T7 RNA polymerase. عند وضعه على المنبع مباشرة لعنصر LacO ، يُعرف الكاسيت بأكمله باسم مروج T7lac.

لاكو: موقع ملزم لـ LacI. يثبط هذا العنصر نشاط محفز T7 عند وجود بروتين LacI ، مما يمنع التعبير المتسرب للجين المعني.

RBS: موقع ربط الريبوسوم وعنصر بدء الترجمة من بكتيريا T7. هذا يسمح للإنتاج الفعال للبروتين محل الاهتمام.

ORF: يتم وضع إطار القراءة المفتوح للجين الذي يهمك هنا.

فاصل T7: تسلسل الإشارة لإنهاء النص المصنوع من الجين المعني ، مما يمنع النسخ المتكرر.

الأمبيسلين: جين مقاومة الأمبيسلين. يسمح بالحفاظ على البلازميد عن طريق اختيار الأمبيسلين في الإشريكية القولونية.

pBR322 ori: أصل pBR322 من النسخ المتماثل. توجد البلازميدات التي تحمل هذا الأصل بالإضافة إلى جين Rop بأعداد نسخ منخفضة في الإشريكية القولونية.

حبل: القامع من التمهيدي. إنه يشفر بروتينًا صغيرًا ينظم عدد نسخة البلازميد. يؤدي وجود بروتين Rop ، في تركيبة من أصل pBR322 للتكاثر على البلازميد ، إلى انخفاض عدد نسخ البلازميد.


التعبير الجيني النبات المتجه الثنائي الأجرعة

يعتبر التحول الجيني بوساطة الأجرعية باستخدام ناقلات ثنائية طريقة قوية وفعالة لتوليد النباتات المحورة جينيا. استخدم هذا النظام قدرة البكتيريا Agrobacterium tumefaciens على إدخال الحمض النووي الغريب في جينوم خلايا العديد من الأنواع النباتية.

يُشتق نظام النواقل الثنائية Agrobacterium من البلازميدات المحفزة للورم الطبيعي (Ti). تنقل الأجرعية منطقة من بلازميد Ti المعروفة باسم نقل الحمض النووي (T-DNA) إلى العديد من الأنواع النباتية ، حيث يتم دمجها في جينوم المضيف. يتم تحديد T-DNA بإحاطة 25 زوجًا من تسلسل تكرار حدود T-DNA ، في اتجاه مباشر مع بعضها البعض. في نظامنا المتجه الثنائي ، تمت إزالة جميع تسلسلات T-DNA المتداخلة المرتبطة بالورم ، تاركة حدود T-DNA تتكرر ، والتي تحيط وتكامل المضيف المباشر لتسلسل المستخدم و rsquos ذي الأهمية.

يتكون نظام المتجه الثنائي الكامل من جزأين. الأول ، الذي يشار إليه باسم ناقل T-DNA الثنائي (أو ببساطة ناقل & lsquobinary & rsquo) ، يحتوي على تكرارين من T-DNA يقسمان تسلسل الحمض النووي الذي سيتم إدخاله في مضيف النبات. يتم استنساخ جين المستخدم و rsquos في هذا الجزء من المتجه الثنائي. البلازميد الثاني ، يشار إليه بالبلازميد المساعد vir ، يشفر المكونات الضرورية لتكامل المنطقة المحاطة بتكرار T-DNA في جينوم الخلايا النباتية. قبل تحويل الخلايا النباتية المستهدفة ، يتم تجميع هذين البلازمدين معًا في الأجرعية المورمة عن طريق التحويل المشترك ، أو التثقيب الكهربائي المشترك ، أو الاقتران.

عندما يكون كل من المتجه الثنائي و vir helper plasmid موجودًا في نفس الخلية Agrobacterium ، تعمل البروتينات المشفرة بواسطة البلازميد المساعد vir على عناصر تكرارية على حدود T-DNA للتوسط في المعالجة والإفراز وتكامل الجينوم المضيف للتسلسل بين كرر الحدود اليمنى واليسرى العناصر. يحدث الإدراج دون أي تحيز كبير فيما يتعلق بتسلسل موقع الإدخال.

لمزيد من المعلومات حول نظام المتجهات هذا ، يرجى الرجوع إلى الأوراق أدناه.

مراجع عنوان
فيزياء النبات. 146: 325-32 (2008) مراجعة أنظمة ناقل الحمض النووي الثنائية.
الاتجاهات في علوم النبات. 5: 446-51 (2000) مراجعة أنظمة ناقل الحمض النووي الثنائية.

يسلط الضوء

يتيح نظام النواقل الثنائية Agrobacterium إمكانية الإدخال الفعال للتسلسلات في جينومات الخلايا النباتية المستهدفة. تم تحسين بلازميد المتجه الثنائي للتكرار في E. coli و Agrobacterium ، والتكامل الفعال للتسلسلات المختارة من قبل المستخدم في الخلايا النباتية المستهدفة ، والتعبير عالي المستوى عن الجينات المحورة.

مزايا

التكامل الدائم للحمض النووي الناقل: ينتج عن تعداء العدوى التقليدية تسليم عابر للحمض النووي إلى الخلايا المضيفة بسبب فقدان الحمض النووي الوراثي بمرور الوقت. هذه المشكلة بارزة بشكل خاص في الخلايا سريعة الانقسام. في المقابل ، يمكن أن يؤدي تحول الخلايا النباتية مع نواقل الأجرعية إلى توصيل الجينات بشكل دائم إلى خلايا النبات المضيف بسبب تكامل منطقة T-DNA في جينوم المضيف.

البساطة التقنية: يعتبر تحول الأجرعية مع النواقل الثنائية أمرًا بسيطًا تقنيًا ، كما هو الحال مع تحول الخلايا النباتية باستخدام النواقل الثنائية والجراثيم.

مساحة شحن كبيرة جدًا: يمكن أن يستوعب نظامنا الناقل الثنائي Agrobacterium إدخالات DNA كبيرة جدًا. بشكل عام ، يمكن استنساخ الإدخالات التي تصل إلى 20 كيلو بايت بكفاءة إلى خلايا مستهدفة.

سلبيات

3 & رسقوو المحذوفات: داخل النبات ، من الشائع أن يؤدي التحلل النووي إلى حذف التسلسل من الحد الأيسر لـ T-DNA (على سبيل المثال 3 & rsquo). ومع ذلك ، لا يعد هذا مصدر قلق كبير بشكل عام لأن تسلسل المستخدم و rsquos يتم استنساخه بالقرب من الحد الأيمن ، لذلك يؤثر التدهور من خسارة الحد الأيسر على جين العلامة.

مطابقة سلالات وعلامات الأجرعية: يجب توخي الحذر لاختيار سلالات الأجرعية التي تعمل بشكل فعال مع المتجه الثنائي المحدد والعلامات المستخدمة. على سبيل المثال ، تُظهر بعض سلالات الأجرعية بالفعل مقاومة لبعض المضادات الحيوية ، ولا يمكن استخدام ناقلات ثنائية مع علامات الانتقاء هذه في هذه السلالات.

تكامل متواليات العمود الفقري: في بعض الحالات ، قد يحدث تكامل متواليات العمود الفقري للناقل جنبًا إلى جنب مع التسلسل المحاط بحدود T-DNA. تحدث هذه الظاهرة بشكل أقل تواترًا عند استخدام نسخة منخفضة من البلازميدات الأجرعية ، كما هو الحال في نظام ناقلات ثنائي لدينا.

المكونات الرئيسية

المروجين: يتم وضع المروج الذي يقود الجين الذي يهمك هنا.

كوزاك: تسلسل إجماع كوزاك. يتم وضع هذا أمام كودون البداية لـ ORF ذي الأهمية لتسهيل بدء الترجمة في حقيقيات النوى.

ORF: يتم وضع إطار القراءة المفتوح للجين الذي يهمك هنا.

Nos pA: إشارة polyadidylation nopaline synthase من الأجرعية. هذا يسهل نسخ إنهاء ORF المنبع.

تكرار RB T-DNA: تكرار الحد الأيمن من T-DNA. عند التعرف عليه بواسطة Ti plasmid في Agrobacterium ، يتم نقل المنطقة بين تكرارات حد T-DNA إلى الخلايا النباتية.

pVS1 StaA: بروتين الاستقرار من pVS1 البلازميد. ضروري لفصل البلازميد المستقر في الأجرعية.

pVS1 ريبا: بروتين النسخ المتماثل من pVS1 البلازميد. يسمح باستنساخ البلازميدات منخفضة النسخ في الأجرعية.

pVS1 oriV: أصل النسخ المتماثل من pVS1 البلازميد. يسمح باستنساخ البلازميدات منخفضة النسخ في الأجرعية.

pBR322 ori: أصل pBR322 من النسخ المتماثل. يسهل تكاثر البلازميد في الإشريكية القولونية. توجد البلازميدات التي تحمل هذا الأصل بأعداد نسخ منخفضة (15-20 لكل خلية) في E. coli في حالة وجود بروتين Rop ، أو أعداد نسخ متوسطة (100-300 لكل خلية) في حالة غياب بروتين Rop.

كاناميسين: الجين المقاوم للكاناميسين. يسمح بالحفاظ على البلازميد عن طريق اختيار الكاناميسين في العوائل البكتيرية.

تكرار LB T-DNA: تكرار الحد الأيسر لـ T-DNA. عند التعرف عليه بواسطة Ti plasmid في Agrobacterium ، يتم نقل المنطقة بين تكرارات حد T-DNA إلى الخلايا النباتية.

تم تحسين CaMV 35S: محفز كيميري قوي يقود تعبير العلامة.

CaMV 35S باسكال: فيروس فسيفساء القرنبيط 35S إشارة polyadidylation. هذا يسهل إنهاء النسخ وعديد الأدينيل لجين العلامة.

علامة: جين اختيار الدواء ، يسمح بانتقاء الخلايا النباتية المنقولة مع الناقل.


مراجعة جديدة لتسلسل البلازميد pBR322.

تم الإبلاغ عن تسلسل منقح في المنطقة المنبع مباشرة من الجين rop لـ pBR322. لا يوجد زوجان أساسيان في التسلسل المقبول في DNA البلازميد. على وجه التحديد ، يكون زوج قاعدة TA مفقودًا عند تنسيق التسلسل 1893 [Sutcliffe، Cold Spring Harbour Symp. كمية. بيول. 43 (1979) 77-90] وزوج أساسي AT مفقود في الموضع 1915 ، مما يعطي حجمًا إجماليًا لـ pBR322 يبلغ 4361 نقطة أساس. هذه التغييرات في تسلسل بدء ترجمة محتمل وربما تعكس أخطاء في التسلسل الأصلي بدلاً من التطور الأخير للبلازميد.


الملخص

أثناء بناء سلسلة Messing pUC plasmid ، تم إنشاء حبل(ذاكرة للقراءة فقط) تم حذف جين pBR322 الذي يتوسط نشاط RNAI. وقد أدى ذلك إلى ارتفاع عدد النسخ لبلازميدات pUC مما يجعل التعبير عن نشاط β-galactosidase التأسيسي في مضيف يحتوي على I qtss لاك كاظمة. نصف بناء سلسلة جديدة من النواقل التي تحتفظ بموقع الاستنساخ المتعدد PUC (MCS) ولكن تم فيه استعادة التحكم في رقم النسخ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن لاك/لاك تم إدراج منطقة تعبير المروج في أ هباأنا كاسيت. هذا يسهل حركة استنساخ الحمض النووي المؤتلف داخل MCS. كما أنه يزيد من النشاط التكميلي لـ لاك الببتيد بترتيب من حيث الحجم ، مما يسمح باختيار المؤتلفات من خلال النمط الظاهري لاك على أجار MacConkey.

العنوان الحالي: Fison plc.، Pharmaceutical Division، Bakewell Road، Loughborough، Leicestershire، LE11 0RH، England.


البلازميد مع ITPG و pBR322 ori - علم الأحياء

مطلوب للتكرار الآلي للبلازميد باستخدام آلية النسخ المتماثل للمضيف.
تعتمد جميع البلازميدات المستخدمة بشكل شائع تقريبًا على أصل ColE1 للتكرار (ORI).

تجدر الإشارة إلى أن الأصول البكتيرية للتكاثر منظمة بإحكام.
في حين أن عوامل R أصغر من جينوم المضيف (10 5 bp مقارنة بـ 5x10 6 bp) ، فإن تكرار هذه العوامل إلى عدد نسخ مرتفع في المضيف يضع عبئًا كبيرًا على آلية النسخ المتماثل للمضيف. لذلك يتم تنظيم أصول النسخ المتماثل بشكل سلبي للحفاظ على انخفاض عدد النسخ (عادةً من 5 إلى 10 نسخ لكل خلية).
في حين أن عدد النسخ المرتفع غير ملائم في النظام الطبيعي ، إلا أنه ميزة مرغوبة في ناقل الاستنساخ - حيث أن الفكرة بأكملها هي القدرة على عزل كميات كبيرة من تسلسلات DNA معينة بسهولة. لذلك تم بذل جهد كبير في هندسة ColE1 ori بحيث يتم تعطيل الآليات التنظيمية السلبية التي تحد من عدد النسخ المؤقتة. لذلك غالبًا ما تسمى نواقل البلازميد الحديثة بـ "النسخ المتماثلة الجامحة" وتتواجد بمعدل 100 إلى 1000 نسخة لكل خلية.

تعتبر الواسمات المختارة ضرورية لتحديد البكتيريا التي تحتوي على البلازميدات المؤتلفة. يمكن تقسيم الاختيار إلى نوعين:

يستخدم الاختيار الإيجابي لتحديد البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. العلامات الأكثر شيوعًا المستخدمة في الاختيار الإيجابي هي جينات مقاومة المضادات الحيوية التي تحملها عوامل R الأصلية.
في حين أن العديد من المضادات الحيوية وجينات المقاومة متوفرة ، فإن المضادات الحيوية شائعة الاستخدام تنقسم إلى فئتين عامتين:

يعتبر ربط شظايا الدنا الغريبة في نواقل البلازميد عملية غير فعالة نسبيًا - يمكن للربط إما إنتاج بلازميد معاد تدويره بدون إدخال ، أو بلازميدات تحتوي على مادة دنا أجنبية. يتم بعد ذلك تحويل هذه المنتجات إلى مضيف بكتيري حساس للمضادات الحيوية ، ويتم تطبيق اختيار إيجابي لتحديد البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. نظام الانتقاء الثاني ضروري للتمييز بين البلازميدات المعاد تدويرها فقط من تلك التي تحمل إدخال DNA غريب.
من أجل تحديد تلك البلازميدات التي تحمل جزء دنا أجنبي ، يتم اختيار موقع الإدخال بحيث يؤدي الإدخال إلى تعطيل علامة قابلة للتحديد - وهي ظاهرة نسميها تعطيل الإدخال.

يتم استخدام نوعين من العلامات القابلة للتحديد للتحديد السلبي

من أجل استخدام مقاومة المضادات الحيوية كنظام اختيار سلبي وإيجابي ، يجب أن يحمل ناقل البلازميد جينين مختلفين من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. مثال على هذا المتجه هو pBR322.

يحمل pBR322 كلاً من جين مقاومة الأمبيلين والتتراسيكلين.
النمط الظاهري للبكتيريا التي تحتوي على البلازميد السليم أمبير ص تيت ص

إدخال الحمض النووي الأجنبي في
موقع Pst I الموجود في جين Amp r ينتج عنه ملف أمبير s تيت ص النمط الظاهري.

على العكس من ذلك ، يؤدي إدخال الحمض النووي الغريب في مواقع EcoRI أو Hind III أو Sal I الموجودة في جين Tet r إلى ظهور
أمبير r تيت s النمط الظاهري.

ثم يتم ضبط المستعمرات المختارة بشكل إيجابي على وسائط انتقائية إيجابية
(اللوحة الرئيسية التي نستعيد منها المتجه المطلوب + الإدخال)

وعلى وسائط الاختيار السلبية.
(وسائط Amp أو Tet على التوالي)

التثبيط الإدراج للنشاط الأنزيمي

بينما يعمل التعطيل التدخلي لمقاومة المضادات الحيوية ، فإنه يتطلب الكثير من التلاعب - انتقاء البكتيريا المختارة بشكل إيجابي واستبدال وسائط الاختيار السلبية وما إلى ذلك. حيث يتم إدخال شظايا الحمض النووي الغريبة.

شجعت هذه القيود على تطوير مجموعة من أنظمة العائل النواقل التي يمكن فيها الاختيار الإيجابي للبكتيريا التي تحمل البلازميد والانتقاء في نفس الوقت لتعطيل النشاط الإنزيمي. يعتمد هذا النظام على صديقنا القديم
جين بيتا جالاكتوزيداز في أوبرون إي كولاي لاك.


بلازميد

  • البلازميدات عبارة عن جزيئات صبغية إضافية ، ذاتية التكاثر ، دائرية في العادة ، جزيئات DNA مزدوجة الجديلة توجد بشكل طبيعي في العديد من البكتيريا وكذلك في بعض الخمائر.
  • على الرغم من أن البلازميدات ليست ضرورية لنمو الخلايا وانقسامها بشكل طبيعي ، إلا أنها غالبًا ما تمنح خصائص مفيدة للمضيف مثل مقاومة المضادات الحيوية التي يمكن أن تكون ميزة انتقائية في ظل ظروف معينة.
  • يختلف حجم البلازميد من 1 إلى 500 كيلو زوج قاعدي. قد يكون عدد البلازميد في الخلية من 1 إلى 4 نسخ أو من 10 إلى 100 نسخة.
  • هناك العديد من نواقل استنساخ البلازميد مثل PBR322 و pSC102 و ColE1 و pUC و pRP4 و pRK2 و pRSF1010 و pEY و pWWO و Ti- و Ri-DNA البلازميد إلخ.

بلازميد pBR322: يحتوي هذا البلازميد على اثنين من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية المختلفة الأمبيسيلين والتتراسيكلين ومواقع التعرف على العديد من الإنزيمات المقيدة.

البلازميد pUC19: يتكون من 2686 زوجًا أساسيًا ويمتلك جين amp r وجين lac Z وجين lac I.

في pUC19 ، يتم دمج تسلسل الاستنساخ المتعدد (MCS) في جين lac Z دون التدخل في وظائف الجينات الأخرى.


3. المضيف

  • تسمى الخلية التي تستقبل rDNA المضيف
  • تتوفر أنواع عديدة من الخلايا المضيفة على سبيل المثال. الإشريكية القولونية ، الخميرة ، الخلايا الحيوانية أو النباتية
  • coli هي أكثر الكائنات الحية استخدامًا في الهندسة الوراثية
  • الحمض النووي هو جزيء ماء ويمكن أن & # 8217t يمر عبر غشاء البلازما
  • الحمض النووي عبارة عن جزيء محب للماء ، ويمكنه & # 8217t المرور عبر أغشية الخلايا ، لذلك يجب أولاً جعل الخلايا البكتيرية "مؤهلة" لأخذ الحمض النووي
  • لذلك ، يتم إجراء علاجات معينة في الذات المضيفة لتصبح مؤهلة لتناول الحمض النووي الريبي

ط) الطريقة الكيميائية

  • علاج الخلايا البكتيرية بتركيز محدد من الكالسيوم ثنائي التكافؤ. هذا يزيد من فرص دخول الحمض النووي الريبي في جدار الخلية البكتيرية من خلال المسام الصغيرة
  • حضانة الخلايا البكتيرية مع الحمض النووي المؤتلف على الجليد. هناك بعد ذلك يتم وضعها لفترة وجيزة عند 42 & # 8217C بعد أن يتم نقلها مرة أخرى على الجليد. تمكن هذه العملية البكتيريا من تناول الحمض النووي الريبي

II) طريقة الحقن المجهري

  • في هذه الطريقة ، يتم حقن محلول rDNA مباشرة في نواة الخلايا الحيوانية
  • تساعد الماصات الدقيقة من الطبقة الشعرية أو الحقن الدقيقة على حقن الحمض النووي الريبي في الخلايا المضيفة
  • هذا هو الأكثر شيوعًا في حالة الخلايا الحيوانية.

ثالثا) طريقة البنادق الجينية

  • تُعرف هذه التقنية أيضًا باسم التقنية البيولوجية.
  • يتم قصف الجزيئات عالية السرعة من الذهب أو التنجستن المطلية بـ rDNA على الخلايا المضيفة
  • تستخدم هذه الطريقة في الغالب في الخلايا النباتية.

رابعا) طريقة Electroporation لل

  • Electroporation هي تقنية تستخدم لتغيير نفاذية غشاء الخلية للخلايا لامتصاص الحمض النووي الريبي في الوسط
  • أداة Electroporator تستخدم لتطبيق الجهد المناسب لجعل نفاذية الخلية
  • Electroporation مفيد في تحويل البكتيريا والفطريات والخلايا النباتية والخلايا الحيوانية

ينتج عدد النسخ المرتفع من البلازميد pUC عن طفرة نقطية قابلة للقمع في Rom / Rop في RNA II

البلازميدات pUC18 و pUC19 هي مشتقات pBR322 تتكاثر عند عدد نسخ أعلى بعدة أضعاف من الأصل أثناء نمو الإشريكية القولونية عند 37 درجة مئوية. التمهيدي ، RNA II ، وأن التأثيرات المظهرية لهذه الطفرة يمكن قمعها بواسطة Rom (RNA one modulator) / Rop protein أو عن طريق خفض درجة حرارة النمو إلى 30 درجة مئوية. ، حيث يتم زيادة عدد النسخ. أثناء النمو الطبيعي للخلايا ، لا تؤثر طفرة pUC على طول أو وظيفة RNA I ، وهو مثبط مضاد لتكاثر DNA البلازميد ، ولكن قد يغير ، كما يقترح تحليل الكمبيوتر ، البنية الثانوية لـ pUC RNA II. نقترح أن طفرة pUC تعيق التفاعلات بين المثبط والتمهيدي من خلال إنتاج تغيير يعتمد على درجة الحرارة لتشكل RNA II. قد يعزز بروتين Rom / Rop الطي الطبيعي للحمض النووي الريبي الطافر II أو ، بدلاً من ذلك ، قد يتيح تفاعل RNA II المطوي على النحو الأمثل مع المكبِط.


شاهد الفيديو: Construction of a Plasmid Vector HD Animation (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Hurst

    الهذيان الحصري ، في رأيي

  2. Yokora

    لقد ردت بسرعة ...

  3. Tas

    فيه شيء. شكرا للمساعدة بهذا السؤال. لم أكن أعلم أنه.

  4. Tobie

    أعني أنك لست على حق. أعرض مناقشته. اكتب لي في PM ، سنتحدث.

  5. Blainey

    في رأيي ، أنت ترتكب خطأ. يمكنني الدفاع عن موقفي. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا في PM ، وسنناقش.

  6. Slaton

    أنت تعترف بالخطأ. سوف نأخذة بعين الاعتبار.



اكتب رسالة