معلومة

استخراج هلام الحمض النووي: الملوثات الكيميائية

استخراج هلام الحمض النووي: الملوثات الكيميائية


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بإجراء استخراج جل لتنقية الحمض النووي بعد هضم مزدوج باستخدام EcoRI و BamHI. بعد استخلاص الجل ، أحتاج إلى إكمال خطوة الربط قبل التحول البكتيري. المشكلة التي أواجهها هي أن الحمض النووي بعد استخلاص الهلام به نوع من الملوثات الكيميائية التي لن تسمح لي بتحديد الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي النانوي. أحصل على نسب منخفضة جدًا 260/230.

هل لدى أي شخص بعض المشاكل مع هذا؟

أنا أستخدم مجموعة Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit.


فيما يلي بعض الأسباب المحتملة:

  1. محصولك منخفض للغاية ، وهو ما يمكنك الاستدلال عليه من انخفاض امتصاص 260. تأكد من أن ملخص التقييد الخاص بك فعال أو أضف المزيد من الركيزة إلى تفاعل الهضم.
  2. تلوث بالكربوهيدرات ، مما يؤدي إلى امتصاص 230 عاليًا. اغسل العمود مرة أخرى باستخدام المخزن المؤقت QG (تم وصف الخطوة في دليل استخراج هلام Qiagen ؛ إذا كنت تقوم بالفعل بغسل باستخدام المخزن المؤقت QG ، فقم بعمل واحد إضافي).
  3. لم تقم بتجفيف العمود بدرجة كافية وبقي بعض الإيثانول من الغسيل في العينة. يمكن أن يتسبب ذلك أيضًا في ارتفاع امتصاص 230 وعينتك برائحة الإيثانول. ضع العمود في أنبوب تجميع فارغ وقم بتدويره لأسفل لفترة طويلة (15-20 دقيقة). لا تقلق ، يمكن للحمض النووي أن يصمد أمامه.

10 نصائح للحصول على نتائج أفضل لاستخراج هلام الحمض النووي

يعرف أي شخص عمل في مختبر البيولوجيا الجزيئية أن استخراج هلام الحمض النووي يمكن أن يمثل تحديًا مفاجئًا. لماذا هذا؟ هل هو بسبب ضعف إنتاجية المنتج ، أو ربما لأن عملية استخراج الهلام تستخدم مواد كيميائية قاسية وظروف (على سبيل المثال ، أملاح chaotropic ، بروميد إيثيديوم ، إيثانول ، حرارة) التي من شأنها إتلاف أو تغيير طبيعة الحمض النووي ومن المحتمل أن تقلل من نجاح الاستنساخ.

في هذه المقالة ، نشارك بعض النصائح لمساعدتك على زيادة عائداتك من الحمض النووي عالي الجودة من عملية استخراج الهلام.


مجموعات ومكونات Monarch® DNA gel ، New England Biolabs

Avantor & reg ، إحدى شركات Fortune 500 ، هي المزود العالمي الرائد للمنتجات والخدمات ذات المهام الحرجة للعملاء في مجال الأدوية الحيوية والرعاية الصحية والتعليم والحكومة والتقنيات المتقدمة وصناعات المواد التطبيقية. تُستخدم محفظتنا في كل مرحلة تقريبًا من مراحل أنشطة البحث والتطوير والإنتاج الأكثر أهمية في الصناعات التي نخدمها. تأتي إحدى أعظم نقاط قوتنا من امتلاك بنية تحتية عالمية ذات موقع استراتيجي لدعم احتياجات عملائنا. تمكننا بصمتنا العالمية من خدمة أكثر من 225000 موقع للعملاء وتمنحنا وصولاً مكثفًا إلى مختبرات البحث والعلماء في أكثر من 180 دولة. نضع العلم في حركة لخلق عالم أفضل. للحصول على معلومات ، قم بزيارة www.avantorsciences.com وتجدنا على LinkedIn و Twitter و Facebook.

& نسخ 2021 VWR International، LLC. كل الحقوق محفوظة.
& نسخ 2021 FORTUNE Media IP Limited جميع الحقوق محفوظة. مستخدمة بموجب ترخيص.

لا يدعم موقع الويب هذا إصدار Internet Explorer الخاص بك. نوصيك بالترقية إلى Internet Explorer 11 أو مستعرض آخر مدعوم ، والتحقق لمعرفة ما إذا كنت تستخدم IE11 في وضع عرض التوافق.



يعد عزل الحمض النووي خطوة حاسمة في علم الأحياء الجزيئي. من الضروري الحصول على جزء معين من الحمض النووي من الحمض النووي المستخرج في تقنيات البيولوجيا الجزيئية. بعد عزل البلازميدات ، قد تحتوي على بعض تلوث الحمض النووي الصبغي ، مما يؤدي إلى مقاطعة المعالجة الإضافية للاستنساخ. لذلك من الأفضل استعادة DNA البلازميد عن طريق التصفية من المواد الهلامية agarose (الاستخلاص). تتمثل الخطوة الأولى في استخلاص الحمض النووي في تحديد نطاق الحمض النووي المراد استخلاصه ، عن طريق الإضاءة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ثم يتم قطع الشريط المطلوب بعناية بواسطة شفرة مشرط. هناك عدة طرق لاستخراج الحمض النووي من المواد الهلامية الاغاروز. استعادة الحمض النووي من المواد الهلامية الاغاروز عن طريق الرحلان الكهربائي على غشاء السليلوز DEAE هي إحدى الطرق السريعة والفعالة. يعد التلوين الكهربائي أيضًا طريقة جيدة لاستعادة الحمض النووي خاصة لشظايا الحمض النووي الكبيرة. تُستخدم عدة طرق للمجموعة أيضًا في المختبرات. في الشطف الكهربائي ، يتم وضع جزء الجل من شريط الحمض النووي المطلوب في كيس غسيل الكلى مع المخزن المؤقت. يتم بعد ذلك وضع الكيس في علبة هلامية تحتوي على محلول عازل وتعريضه لتيار كهربائي. يتم ترسيب الحمض النووي المستخرج من المحلول. في طريقة استرجاع أخرى باستخدام غشاء السليلوز DEAE ، تنزلق قطعة الجل في شق ورق السليلوز DEAE الذي سيربط الحمض النووي. ثم يتم تطبيق تيار كهربائي لتحريك الشريط في الورقة. يُغسل الحمض النووي من الورق ويترسب بالإيثانول. طريقة الاستخراج بالتجميد والذوبان هي طريقة مفيدة شائعة الاستخدام لاستعادة الحمض النووي والتي ستدعم مرافق المختبر المشتركة. إنه بسيط للغاية وسهل الأداء مع عائد جيد.


تستخدم معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية درجة انصهار منخفضة الاغاروز لفصل الحمض النووي عن الاغاروز. يذوب الاغاروز ذو نقطة الانصهار المنخفضة عند درجة حرارة أقل من الاغاروز القياسي ودرجة الحرارة هذه لا تفسد الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. من الأفضل استخراج شظايا الحمض النووي في هلام TAE المخزن من الجل المخزن TBE لأن البورات الموجودة في المخزن المؤقت تتداخل مع طرق التنقية.


تصميم عمود فريد

لم يتم تصميم أعمدة Monarch لاستخدام كميات أقل من البلاستيك فحسب ، بل تم تحسينها أيضًا للتخلص من الاحتفاظ بالمخزن المؤقت. تم تصميم أعمدة Monarch بدون حلقة احتجاز ، وبالتالي تمنع الأملاح من الانتقال إلى عيناتك المملوءة. يتيح التصميم المدبب للعمود أيضًا شطف منخفض الحجم (& ge 6 & microl).

تصميم عمود تنظيف الحمض النووي العاهل
تم تصميم أعمدة Monarch للأداء
تم تصميم أعمدة Monarch بدون مزيج فريت ، مما يقضي على احتباس المخزن المؤقت وخطر التلوث المرحل ، مما يوفر تنقية سريعة خالية من القلق للحمض النووي.

تنقية فعالة للحمض النووي من المواد الهلامية والتفاعلات الأنزيمية

تتيح مجموعات Monarch تنقية فعالة للحمض النووي عالي النقاء وعالي التركيز من التفاعلات الأنزيمية والمواد الهلامية agarose. الحمض النووي المنقى جاهز للاستخدام في عمليات المعالجة النهائية مثل عمليات الربط والتقييد.

تنقية القلة وشظايا الحمض النووي الصغيرة

يمكن تعديل بروتوكول Monarch PCR & amp DNA Cleanup Kit لتمكين تنقية ssDNA و oligonucleotides وشظايا الحمض النووي الصغيرة الأخرى. يزيل بروتوكول تنظيف قليل النوكليوتيد بكفاءة النيوكليوتيدات غير المدمجة والأوليجوس القصيرة والأصباغ والإنزيمات والأملاح من الملصقات والتفاعلات الأنزيمية الأخرى. يستخدم البروتوكول المعدل نفس الأعمدة ويربط / يغسل / سير عمل مجموعة Monarch PCR & amp ؛ تنظيف DNA مع & gt 70٪ استرداد وتنظيف قليل النوكليوتيدات & ge 15 bp (dsDNA) أو & ge18 nt (ssDNA).

استعادة أليغنوكليوتيدات ssDNA و dsDNA (1 & microg) باستخدام بروتوكول تنظيف Oligonucleotide ومجموعة Monarch PCR & amp DNA Cleanup.

أشرطة فيديو

بروتوكول طقم استخراج جل الحمض النووي من مونارك وريج

تعرف على كيفية استخراج الحمض النووي من المواد الهلامية agarose باستخدام مجموعة Monarch DNA Gel Extraction Kit.

نصائح لاستخدام طقم استخراج جل DNA Monarch & reg

قم بتحسين استخلاص هلام الحمض النووي الخاص بك من خلال نصائحنا السريعة لاستخدام مجموعة Monarch DNA Gel Extraction Kit.

كيفية إعادة تدوير مكونات Monarch & Reg Kit

تعرف على كيفية إعادة تدوير جميع المكونات الموجودة في أطقم Monarch الخاصة بك بسهولة.


ما هي العوامل التي تؤثر على الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز DNA؟

  1. عينة الحمض النووي- النوع والنقاء والكمية.
  2. متعادل- تركيز ودرجة الحموضة من نوع العازلة والعازلة.
  3. الحقل الكهربائي- الجهد المطبق الحالي وشحنة الجسيمات.
  4. آخر- تحضير الهلام ، تركيز الهلام ، مواد كيميائية أخرى.

نوع العينة:

تُستخدم تقنيات متنوعة من الرحلان الكهربائي للهلام لفصل البروتينات والحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA). على الرغم من أن الأسلوب الأساسي للفصل لا يزال كما هو ، إلا أنه يلزم إجراء تغييرات طفيفة.

الحمض النووي الريبي أصغر من الحمض النووي ، وبالتالي يهاجر أسرع من الحمض النووي في الهلام. لذلك لتشغيل هلام RNA ، نحتاج إلى هلام بتركيز مختلف (نحن لا نتحدث عن البروتين هنا).

يختلف تركيز مادة هلامية في الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA). كما أن لنوع العينة تأثير معنوي على نتائج الرحلان الكهربائي للهلام. يختلف تركيز الجل وتقنية التحضير ووقت التشغيل وعوامل أخرى حسب أنواع العينة.

نقاء الحمض النووي:

يتسبب سوء المناولة واستخراج الحمض النووي غير المناسب في حدوث مشكلات خطيرة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والرحلان الكهربي. للحصول على نتائج جيدة ، يجب أن يكون الحمض النووي نقيًا تقريبًا. يوصى بشدة باستخدام DNA بنسبة 260/280 تقريبًا 1.80.

لتشغيل gDNA ، ينتقل الحمض النووي النقي بشكل صحيح في مادة هلامية ، على العكس من ذلك ، لا يمكن تفسير نمط انتقال الحمض النووي الملوث.

هناك ملوثان شائعان لاستخراج الحمض النووي هما الحمض النووي الريبي والبروتين. لوحظ وجود مسحة أسفل الحمض النووي ولطاخة فوق نطاق الحمض النووي عندما تتلوث بالبروتين والحمض النووي الريبي ، على التوالي. ينفصل الحمض النووي النقي بالتساوي ، بشكل جميل ومميز في مادة هلامية.

إذا كنت ترغب في تحقيق عائد جيد ونوعية جيدة من الحمض النووي ، فهذه المقالة لك: كيف تزيد نقاء الحمض النووي وعائده؟

يظهر هلام الحمض النووي الملوث في الشكل أدناه ،

نتائج الرحلان الكهربائي للهلام الملوثة وغير الملائمة.

تركيز الحمض النووي:

التركيز مهم أيضًا لفصل الحمض النووي تمامًا. تركيز الحمض النووي وحجم المسام الجل لهما علاقة! لا يمكن لشظايا الحمض النووي الأكبر حجمًا أن تنتقل بكفاءة من هلام أصغر حجمًا.

لذلك فإن تركيز الحمض النووي مهم لفصل الحمض النووي والحصول على نتائج جيدة. على سبيل المثال ، لتشغيل الحمض النووي الجيني ، نحتاج إلى 0.8٪ هلام أثناء تشغيل أمبليكون PCR ، نحتاج 2.0٪ هلام.

(هل يمكن أن تخبرني ما هي النسبة المئوية للجيل المطلوب لتقييد الهضم؟)

في بعض الأحيان ، لا يمكن فصل الحمض النووي عالي التركيز على مادة هلامية ، نحتاج إلى تخفيفه ، على الرغم من أن تخفيف العينة يقلل التركيز وليس النقاء. من الناحية المثالية ، يمكن لجيل gDNA 0.8٪ فصل 500 إلى 900 ميكروغرام من الحمض النووي.

نوع المخزن المؤقت:

يعتبر Buffer مكونًا أساسيًا في الرحلان الكهربائي ، حيث يوفر وسطًا سائلًا ثابتًا ودرجة الحموضة أثناء التشغيل. TAE و TBE هما نظامان شائعان يستخدمان على نطاق واسع أثناء الرحلان الكهربائي للهلام للحمض النووي.

ومع ذلك ، كلاهما ليس لهما نفس النشاط. يمكن للمبتدئ استخدام إما للتجربة المتخصصة أو للتحقيقات الحاسمة ، يحتاج الخبير إلى اختيار الأفضل من أي منهما.

يمكن أن يتفاعل البورات مع جزء السكر من الحمض النووي ويؤثر على الهجرة ، وبالتالي لا ينصح به الخبراء. Tris-acetate-EDTA هو الخيار الأول لتشغيل DNA ، في جميع أنحاء العالم.

درجة حموضة المخزن المؤقت:

يعتبر الرقم الهيدروجيني مهمًا مثل العوامل الأخرى ، حيث أن التغييرات الطفيفة في درجة الحموضة في المخزن المؤقت تؤثر سلبًا على هجرة نتائج الحمض النووي والهلام ، وبالتالي. الرقم الهيدروجيني 8.3 مثالي لتشغيل الحمض النووي بشكل مثالي.

تكوين العازلة:

التركيب الكيميائي لعزل TAE هو Tris و acetate و EDTA والتركيب الكيميائي لمخزن TBE هو Tris و bورات و EDTA. يلعب كل مكون دورًا حيويًا في التحكم في الفصل ، لذا فإن تركيزهم وكميته مهمان كثيرًا!

لقد قمنا بتغطية مقال حول هذا الموضوع. يمكنك التحقق من التحضير الكيميائي هنا: Agarose gel electrophoresis buffer.

يؤدي التغيير في التركيب إلى هجرة أبطأ أو تدهور الحمض النووي أو مشاكل أخرى في الرحلان الكهربائي للهلام. لذلك عليك أن تزن وتحضر كل محلول بشكل صحيح. اقرأ المقال أعلاه.

التيار والجهد:

يؤثر التيار والجهد في المدى على الهجرة وفصل الجزيئات الحيوية. عندما يكون التيار المطبق مرتفعًا جدًا ، فإنه يجعل الحمض النووي يعمل بشكل أسرع ، ويسخن الهلام والعازل ويجعل مسحة الحمض النووي.

لا يمكن فصل الحمض النووي بشكل صحيح.

عندما يكون التيار المطبق منخفضًا جدًا ، لا يمكن للحمض النووي أن ينساب من مسام الهلام وينتشر في مادة هلامية. لا يمكن فصل أجزاء الحمض النووي في كلتا الحالتين. من الناحية المثالية ، يُنصح باستخدام تيار من 80 إلى 100 فولت لتشغيل هلام الحمض النووي. لاحظ أن الجهد المطبق يعتمد أيضًا على حجم شظايا الحمض النووي.

يتم تشغيل gDNA من 60 إلى 80 فولت بينما يتم تشغيل أمبليكونات PCR من 100 إلى 120 فولت ، بشكل مثالي. خذ نصيحة خبير قبل تحديد التيار والجهد للجيل. يجب أن يظل تيار الفصل الكهربائي ثابتًا أيضًا أثناء التشغيل الكامل لتشغيل الحمض النووي بسرعة ثابتة.

تركيز الاغاروز:

Agarose هو أحد مكونات هلام الحمض النووي. يتم غليه في المخزن المؤقت لجعله هلام. تختلف كل عينة من عينات الحمض النووي ، وهناك حاجة إلى تركيز متنوع من الاغاروز لتشغيل عينات مختلفة.

تركيز الاغاروز

منتج PCR و DNA البلازميد

إذا تعذر الحفاظ على تركيز الاغاروز وكمية الحمض النووي ، فلا يمكن فصل الأجزاء بكفاءة.

تحضير الجل:

على الرغم من أن الخبرة الفائقة ليست مطلوبة لإعداد مادة هلامية ، فإن تحضير الجل يحدث فرقًا كبيرًا. إذا لم تتم تسوية الجل ، ووجود فقاعات هواء ، وغير موزعة بالتساوي وسمكها غير جيد ، فإن حمضنا النووي لا يمكن أن ينتقل بدقة.

توقف فقاعات الهواء عن تشغيل الحمض النووي ، وهي واحدة من أكثر مشاكل تحضير الهلام شيوعًا التي يواجهها المبتدئون. يحتاج المرء إلى الكثير من التدريب للقيام بذلك على أكمل وجه.

عامل آخر هو سمك الهلام والتوزيع غير المناسب. يجب موازنة عجلة الجل أولاً قبل صب الجل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون كمية الجل كافية أيضًا.

يوصى باستخدام الجل الموزع بالتساوي بسماكة 1 إلى 1.5 سم. إذا كانت السماكة منخفضة جدًا ، فلا يمكن لجزيئات الحمض النووي أن تهاجر بمعدل ثابت.

معالجة الأخطاء:

  • تحضير كيميائي غير دقيق.
  • الوزن العشوائي وإعداد المحلول
  • المصاصة غير دقيقة
  • توازن درجة الحموضة غير دقيق
  • معالجة الأخطاء في استخلاص الحمض النووي
  • تحضير العينة غير الدقيق

عملك الجاد والدقة ينعكسان في عملك ، كيف قمت بإعداد وتشغيل هلام لذلك يجب أن يتم تنفيذ كل خطوة بإخلاص. لا يتم قبول معالجة الأخطاء للكشف عن الطفرات والتحقق من صحة التجارب وتشخيص المرض.

تعتبر المواد الكيميائية والمحلول الماصات من الأخطاء الشائعة الأخرى التي تؤثر على نتائج الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي. تعرف على تقنية سحب العينات الصحيحة ، وفهم وقت استخدام الضغط المزدوج ومتى يجب استخدام الضغط الثلاثي. إلى جانب ذلك ، هناك عوامل أخرى هي تحميل عينات الحمض النووي في الآبار ، ووضع العلامات غير المناسبة للعينات ، وإعداد صبغة BPB ، إلخ.


استعادة الحمض النووي من الجل - ثم تأمينه؟ (26 سبتمبر 2008)

كنت أتساءل عن كيفية تحسين استخراج الحمض النووي من هلام الاغاروز حتى أتمكن من تأمين الفرقة. أستخدم مجموعة qiagen gel الاستخراجية التي تقول إنها تعطي عائدات عالية من الحمض النووي المنقى المناسب للتأمين ، على الإطلاق ، تعود عملياتي المروعة. أي خدعة ، لا أعرف ، تركيز الاغاروز الأمثل ، sybr مقابل بروميد الإيثيديوم ، إلخ؟
أحتاج إلى حل هذه المشكلة في أسرع وقت ممكن
thnx & # 33

نقوم بشكل روتيني باستخراج العصابات من المواد الهلامية agarose باستخدام مجموعة Qiagen ونرسلها للتسلسل ، عادة بدون مشاكل. الشيء الوحيد الذي نفعله يختلف عن المجموعة هو التصفية في الماء ، بدلاً من المخزن المؤقت المقدم (الذي أعتقد أنه مجرد Tris ، درجة الحموضة 8.0).

هل تقيس كمية قالب DNA الذي تستخدمه؟ كيف تبدو تسلسلاتك؟ هل تستخدم نفس البادئات لـ PCR وللتسلسل؟ ما مدى نظافة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تعزل عنه الفرقة؟ ما هو Tm من البرايمر الخاص بك؟ ما هي مدتها؟

أنا شخصياً لا أوصي باستخراج الحمض النووي من الجل للتسلسل أو الاستنساخ ، إلا إذا حصلت على نطاقتين أو أكثر لم تحصل على نتائج جيدة ، ويبدو أن ما أراه في المنتديات يعاني من نفس المشكلة. إذا كان لديك شريط واحد ، استخدم اختبار عمود الدوران لتنظيف المنتج. إذا لم تكن محظوظًا ولديك العديد من النطاقات ، فاستخدم أداة جيدة للذوبان منخفضة الذوبان ، واشتري قاطع النطاق إذا أمكن (حتى تتمكن من العمل بشكل أسرع والحصول على أقل قدر ممكن من الاغاروز). الشيء الآخر الذي يمكن تجربته هو استخدام زوج من البادئات الموجودة في الداخل أكثر للتفاعل المتسلسل.

أهلا،
تتمتع secquences الخاصة بي بشكل أساسي بخلفية عالية جدًا ، وتلقي السيدة في جهاز التسلسل هنا باللوم على نسبة 260/230 الخاصة بي. أيضًا ، هم لا يشبهون ما يفترض أن أراه على الإطلاق & # 33 أنا متأكد من أن قص الفرقة هو الصحيح ، لأن هذا كان جيدًا بالنسبة للشخص الذي كان مسؤولاً عن هذا المشروع قبلي (لقد غادر إلى ما بعد الدكتوراة بالخارج و أنا الآن مسؤول عن هذا المشروع). لدي صور من المواد الهلامية تشير بوضوح إلى الفرقة وهي متطابقة مع صورتي.
أظن أنه ربما يجب أن تحتوي المواد الهلامية هنا على الكثير من بروميد إيثيديوم ، سأحاول هذا الأسبوع مع sybr. سأحاول أيضًا تصميم بادئات متداخلة ، لكن هذا تسلسل فيروسي صعب يصعب الحصول عليه بسهولة & # 33 ، تحتوي البرايمر على درجة حرارة منخفضة جدًا ، وربما يمكن أن يفسر ذلك أيضًا المشكلة ، ولكن كما قلت من قبل ، نجح هذا جيد جدًا للباحث قبلي (الذي أتناوله وليس لديه أدنى فكرة عما يمكن أن يحدث خطأ ويبدو أنه مشغول بالمساعدة هنا)
شكرا جزيلا يا رفاق & # 33

إمكانية أخرى - استنساخ TA لمنتج PCR الخاص بك ، قم بعمل مستعمرة PCR للتأكد من أن لديك الشيء الصحيح ، ثم أرسل نسختك للتسلسل.

نعم ، هذا ما اعتقدته في المقام الأول ، لكن علي أن أفعل أكثر من مائة من هؤلاء خلال هذا الفصل الدراسي ، ولدي مختبر dpesnt حقًا ما يكفي من النقود لجميع مجموعات توبو ، ومضادات الحيوية ، ومجموعات استخراج البلازميد ، إلخ.
قال المستشار فقط أرسل المنتج إلى التسلسل وتنسى كل هذه & quot ؛ يتوهم & quot الخطوات الوسيطة.

نعم ، هذا ما اعتقدته في المقام الأول ، ولكن علي أن أفعل أكثر من مائة من هؤلاء خلال هذا الفصل الدراسي ، ولدي مختبر dpesnt حقًا ما يكفي من النقود لجميع مجموعات توبو ، ومضادات الحيوية ، ومجموعات استخراج البلازميد ، إلخ.
قال المستشار فقط أرسل المنتج إلى التسلسل وتنسى كل هذه & quot ؛ يتوهم & quot الخطوات الوسيطة.

إذا كانت 260/230 هي المشكلة. تنظيف التفاعل مع ترسيب EtoH. لأن 230 عادة تشير إلى تلوث الملح. لدي هذه المشكلة في كثير من الأحيان عندما أقوم باستخراج الهلام. الكثير من الملح ليس مفيدًا أبدًا للتسلسل. تذوب في H20 بعد ذلك. ثم أنت جيد للذهاب & # 33

تأكد من صحة كمية الحمض النووي. يمكن أن تنشأ المتاعب من وجود كمية كبيرة جدًا أو قليلة جدًا من الحمض النووي في تفاعل التسلسل ، وربما تكون المشكلة الأكبر منفردة. تعتبر أجهزة التسلسل الحديثة أكثر ودية للكميات الصغيرة من الحمض النووي ، لكن التفاعل يمكن أن يفشل بشكل كبير مع الكثير. يمكنك محاولة تنقية الحمض النووي الخاص بك ، لكنني أود أولاً التأكد من أنك حصلت على الكمية التي كنت تعتقد أنك فعلتها. يمكنك محاولة إعادة ترسيب الحمض النووي ، والتأكد من غسل الإيثانول بنسبة 70٪ من الحبيبات. يمكن أن يتسبب تلوث العينة بالملح أيضًا في حدوث مشكلات. صف كيف تقوم بتنقية الحمض النووي بعد قطعه من الجل.


الملخص

على مدى السنوات الأخيرة ، أحدثت تقنيات التسلسل والمصفوفات الدقيقة من الجيل التالي ثورة في البحث العلمي من خلال تطبيقاتها لتحليل الإنتاجية العالية للأنظمة البيولوجية. يعد عزل كميات كبيرة من الحمض النووي الجيني النقي ، والسليم ، والمزدوج الجديلة ، والمركّز للغاية ، وغير الملوث شرطًا أساسيًا لإجراء تحليل جيني ناجح وموثوق به على نطاق واسع. كميات كبيرة من الحمض النووي النقي مطلوبة أيضًا لإنشاء بنوك الحمض النووي. في هذه الدراسة ، تم فحص أحد عشر إجراءً مختلفًا لاستخراج الحمض النووي ، بما في ذلك الاستخلاص القائم على الفينول كلوروفورم والسيليكا والخرز المغناطيسي ، للتأكد من فعاليتها النسبية في استخراج الحمض النووي من عينات دم الأغنام. تم لاحقًا تقييم جودة وكمية الحمض النووي المستخرج تفاضليًا عن طريق القياسات الطيفية وقياسات Qubit وتضخمات PCR في الوقت الفعلي والهلام الكهربائي للهلام. تم أيضًا تقييم وقت المعالجة وشدة العمالة والتكلفة لكل طريقة. كشفت النتائج عن اختلافات كبيرة بين الإجراءات الإحدى عشرة وأربعة فقط من الطرق أسفرت عن مخرجات مرضية. كانت هذه الطرق الأربعة ، التي تضم ثلاث مجموعات تجارية معدلة تعتمد على السيليكا (الدم المعدل ، والأنسجة المعدلة ، ومجموعات Dx المعدلة) والبروتوكول القائم على الخرز المغناطيسي المطوَّر داخليًا ، هي الأنسب لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة والكمية المناسبة للتنميط الجيني المجهري على نطاق واسع وكذلك لتخزين الحمض النووي على المدى الطويل كما يتضح من تطبيقها الناجح على 600 فرد.

الاقتباس: Psifidi A و Dovas CI و Bramis G و Lazou T و Russel CL و Arsenos G et al. (2015) مقارنة بين إحدى عشرة طريقة لاستخراج الحمض النووي الجيني مناسبة للتنميط الجيني الكامل للجينوم على نطاق واسع وبنك الحمض النووي طويل الأجل باستخدام عينات الدم. بلوس ون 10 (1): e0115960. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115960

تم الاستلام: 25 سبتمبر 2014 وافقت: 28 نوفمبر 2014 نشرت: 30 يناير 2015

حقوق النشر: © 2015 Psifidi وآخرون. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر

توافر البيانات: جميع البيانات الواردة في الورقة.

التمويل: تم تمويل هذا البحث من قبل برنامج الإطار السبعة التابع للمفوضية الأوروبية ، مشروع 3SR (حلول مستدامة للحيوانات المجترة الصغيرة). رقم اتفاقية المنحة 3SR: FP7-KBBE-2009-3-245140. لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.


هجرة جل الفرقة الغريبة - البيولوجيا الجزيئية (نوفمبر / 22/2005)

مرحبًا ، مشكلتي هي أنه بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أقوم بتشغيل مادة هلامية لتنقية جزء الاهتمام. لقد قطعت نطاق الاهتمام وبعد أن استخرج الحمض النووي باستخدام هلام إضافي. من المدهش للغاية ما أراه بعد الاستخراج. أقوم بتشغيل الفرقة المفردة المنقاة في هلام ويظهر شريطان ، أحدهما بالحجم الصحيح والآخر أصغر (الأصغر حجمًا بكثافة كبيرة ، تقريبًا مثل النطاق الصحيح). منتج PCR الخاص بي غني جدًا بـ A + T ، الحجم 1.6 كيلو بايت ، أعتقد أنه يمكن أن يكون بنية ثانوية في الحمض النووي أو الحلقات أو شيء من هذا القبيل. أعتقد أن هذا الهيكل لا يتشكل في تفاعل المخزن المؤقت PCR (كلوريد الصوديوم ، المغنيسيوم) (في الهلام الأول) ولكن بعد الزيادة يكون الحمض النووي في الماء ويشكل بنائين. إنه ممكن؟ هل هناك سبب آخر؟
شكرا جزيلا
يجعلني مجنون

مجرد فكرة ، لكن هل تحققت من أن كواشف تنقية الهلام خالية من تلويث الحمض النووي؟ لا أعرف ما إذا كان تلوث الحمض النووي سيعطي مثل هذه الفرقة الشديدة ، ولكن يمكن أن يفسر سبب قطع شريط واحد والحصول على اثنين بعد التنقية.

& ltha هل تحققت من أن كواشف تنقية الهلام خالية من تلوث الحمض النووي؟ & GT

لا يمكن أن يكون تلوثًا لأنني أقوم بذلك باستخدام 4 أحجام مختلفة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (لكن متماثل تسلسل متماثل AT rich) وكل 4 بعد التنقية تقدم نطاقين ، والغريب هو الحجم المختلف. الشيء الأكثر إثارة للدهشة هو أن 4 منتجات PCR تتراوح بين 1.5 كيلو بايت و 1.7 كيلو بايت ، والمسافة بين النطاق الصحيح والغريب هي نفسها في كل منهم.
انظر إلى الملف

أود أن & # 39 لا تقلق كثيرًا ، لقد رأيت أنه مع منتجات pCR المنقى بواسطة ترسيب PEG ، فإن ملف تعريف الترحيل لا يكشف عن أي مدخلات مختلطة ، فهو مجرد مشكلة ترحيل.

كيف استخرجت فرقتك الموسيقية؟

هل جربت قطع القيود لمعرفة ما إذا كان لديك ملف التعريف الصحيح؟

ما هو القالب الخاص بك لرد فعل PCR الخاص بك. إذا كان الحمض النووي الريبي هو RNA ، فمن المحتمل أنك ترى أشكالًا إسوية إن وجدت لمنتج يهمك ، حيث إنها تشكل نمطًا أساسيًا في جميع البادئات الأربعة. مجرد فكرة.

كيف استخرجت فرقتك الموسيقية؟
مجموعة استخراج جل Kiagen

هل جربت قطع القيود لمعرفة ما إذا كان لديك ملف التعريف الصحيح؟
لا ، لكنني سأحاول ذلك

ما هو القالب الخاص بك لرد فعل PCR الخاص بك؟

القالب هو الحمض النووي الجيني

نعم ، أعتقد أنها مجرد مشكلة هجرة وليس هناك مزيج من المدخلات.

كيف استخرجت فرقتك الموسيقية؟
مجموعة استخراج جل Kiagen

هل جربت قطع القيود لمعرفة ما إذا كان لديك ملف التعريف الصحيح؟
لا ، لكنني سأحاول ذلك

ما هو القالب الخاص بك لرد فعل PCR الخاص بك؟

القالب هو الحمض النووي الجيني

نعم ، أعتقد أنها مجرد مشكلة هجرة وليس هناك مزيج من المدخلات.

حسنًا ، فقط جرب ملخص التقييد وسترى. أستخدم مجموعة Quiagen بشكل روتيني دون أي مشكلة ولكن من يعرف البيولوجيا الجزيئية

& lt & lt فقط جرب ملخص التقييد وسترى & gt & gt

لقد قمت بعمل ملخص القيد وهو صحيح. إنها ليست أي فرقة غريبة. كان بيسجي محقًا ، لقد كانت مشكلة هجرة فقط.
شكرا جزيلا للجميع


شاهد الفيديو: الحمض النووي والمورثات (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Shagar

    أمور تافهة!

  2. Milo

    أعرف كيف من الضروري الدخول ، والكتابة إلى الشخصية

  3. Trophonius

    تماما أشارك رأيك. ومن المستحسن. أنا أدعمك.

  4. Yeshurun

    يجب أن تكون أكثر تواضعا

  5. Mostafa

    أحب فكرتك. عرض وضع مناقشة عامة.



اكتب رسالة