معلومة

حساب معامل الانقراض لـ GFP

حساب معامل الانقراض لـ GFP


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد تحويل امتصاص البروتين إلى تركيز. ومن ثم فأنا بحاجة لحساب معامل الانقراض للبروتين (GFP). لقد وجدت الصيغة (nTrp) 5500+ (nTyr) 1490 على الإنترنت ولكن لم أتمكن من استخدامها لأنني لا أفهم ما الذي يمثله الأحماض الأمينية وكيف يمكنني الوصول إلى القيمة n


فقط عدد ("n") من الأحماض الأمينية العطرية Tryptophan (Trp) و Tyrosin (Tyr) في البروتين يساهم بشكل كبير في امتصاصه عند 280 نانومتر (وسيستين (Cys) ، وإن كان ذلك بدرجة أقل) ، انظر أيضًا هنا .

يمكنك استرداد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من uniprot (انظر GFP هنا). بالنظر إلى تسلسل GFP ، يمكن للمرء تحديد n = 11 (4.6٪) Tyr و n = 1 (0.4٪) Trp. الآن يمكنك إدراج تلك في الصيغة الخاصة بك وينتهي بك الأمر بمعامل انقراض 21'890 م ^ -1 * سم ^ -1. هذه الصيغة صالحة فقط إذا تم تقليل جميع Cys (GFP لديها n = 2 Cys التي يمكن أن تشكل جسر ثاني كبريتيد).

إذا كنت ترغب في تجنب جميع الصيغ ، أقترح عليك نسخ تسلسل GFP ولصقه في ExPASy ProtParam. بهذه الطريقة تحصل على نظرة عامة لطيفة على توزيع الأحماض الأمينية للبروتين الخاص بك وأيضًا استرداد معامل الانقراض تحت ظروف الأكسدة ، والذي يساوي 22'015 م ^ -1 * سم ^ -1.


الملخص

خلفية: قد تكون متغيرات البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بألوان مختلفة مفيدة جدًا لإجراء مقارنات متزامنة بين مصائر البروتين المتعددة ، والأنساب التنموية ومستويات التعبير الجيني. إن أبسط طريقة لتغيير لون انبعاث GFP هي استبدال الهيستيدين أو التربتوفان بالتيروزين في حامل الصبغيات ، ولكن مثل هذه المسوخات ذات النقاط الزرقاء المزاحة هي فقط الفلورسنت الخافت. أطول الأطوال الموجية التي تم الإبلاغ عنها سابقًا لقمم الإثارة والانبعاثات لطفرات GFP هي 488 و 511 نانومتر ، على التوالي.

نتائج أدت البدائل الإضافية ، بشكل رئيسي في المخلفات 145-163 ، إلى تحسين سطوع طفرات GFP ذات الانزياح الأزرق مع الهيستيدين والتريبتوفان بدلاً من التيروزين 66. وقد دفعت الطفرات المنفصلة الإثارة وقمم الانبعاث لمعظم المسوخات ذات الانزياح الأحمر إلى 504 و 514 نانومتر على التوالي. يمكن الآن تمييز ثلاثة ألوان مختلفة على الأقل من طفرات GFP بشكل واضح عن بعضها البعض تحت المجهر ، باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة. يُظهر بروتين الاندماج المكون من بروتينات فلورية زرقاء وخضراء مرتبطة بنقل طاقة الرنين الفلوري ، والذي يتم تعطيله عن طريق الانقسام المحلل للبروتين للرابط بين المجالين.

استنتاج تظهر نتائجنا أن إنتاج متغيرات أكثر وأفضل من GFP ممكن وجدير بالاهتمام. يسهل إنتاج مثل هذه المتغيرات التصوير متعدد الألوان للتعبير الجيني التفاضلي أو توطين البروتين أو مصير الخلية. قد يكون الاندماج بين المسوخات ذات الألوان المختلفة ركائز مفيدة للاستمرار فى الموقع فحص البروتياز. يعد إظهار نقل الطاقة بين متغيرات GFP خطوة مهمة نحو طريقة عامة لرصد الارتباط المتبادل لبروتينات الاندماج.

Roger Heim and Roger Y. Tsien (المؤلف المقابل) ، معهد هوارد هيوز الطبي 0647 وقسم الصيدلة ، جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو ، لا جولا ، كاليفورنيا 92093-0647 ، الولايات المتحدة الأمريكية.


حساب معامل الانقراض لـ GFP - علم الأحياء

لقد بحثنا في الخصائص ذات الصلة بالتصوير الكمي في الخلايا الحية لخمسة متغيرات من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) التي تم استخدامها على نطاق واسع أو قد تكون مفيدة. قمنا بقياس معاملات الانقراض ، والعوائد الكمومية ، وتأثيرات الأس الهيدروجيني ، وتأثيرات التبييض الضوئي ، وتكوين الكروموفور المعتمد على درجة الحرارة لـ wtGFP ، و alphaGFP (F99S / M153T / V163A) ، و S65T ، و EGFP (F64L / S65T) ، ومتغير أزرق ، EBFP (F64L / S65T / Y66H / Y145F). أظهر التحليل الطيفي للامتصاص والفلورة فرقًا بسيطًا بين معاملات الانقراض والعوائد الكمومية لكل من wtGFP و alphaGFP. في المقابل ، جعلت معاملات الانقراض S65T و EGFP كلاهما أكثر سطوعًا بمقدار 6 أضعاف تقريبًا من wtGFP عند الإثارة عند 488 نانومتر ، وامتصاص EBFP بقوة أكبر من wtGFP عند الإثارة في منطقة الطول الموجي القريبة من الأشعة فوق البنفسجية ، على الرغم من أن لها كفاءة كمية أقل بكثير. . عندما كانت متحمسًا عند 488 نانومتر ، كانت GFPs أكثر مقاومة للتبييض الضوئي من الفلوريسين. ومع ذلك ، أظهرت أنماط التبييض الضوئي wtGFP و alphaGFP زيادات أولية في انبعاث التألق الناجم عن التحويل الضوئي لبروتين كروموفور. انخفض مضان wtGFP بسرعة أكبر عند الإثارة عند 395 نانومتر من 488 نانومتر ، لكنه كان لا يزال أكثر ثباتًا من EBFP عندما يكون متحمسًا عند هذا الطول الموجي. كان كل من wtGFP و alphaGFP مستقرين تمامًا على نطاق واسع من الأس الهيدروجيني ، لكن تألق المتغيرات الأخرى انخفض بسرعة أقل من الرقم الهيدروجيني 7. عند التعبير عنه في البكتيريا ، وجد أن تكوين الكروموفور في wtGFP و S65T أقل كفاءة عند 37 درجة مئوية مقارنة بـ 28 درجة C ، لكن المتغيرات الثلاثة الأخرى أظهرت اختلافات طفيفة بين 37 درجة مئوية و 28 درجة مئوية. في الختام ، لا يوجد متغير GFP واحد مثالي لكل تطبيق ، ولكن كل واحد يقدم مزايا وعيوب للتصوير الكمي في الخلايا الحية.


بروتين أحادي فلوري أحمر

تُظهر جميع البروتينات الفلورية المتألقة المستنسخة حتى الآن شكلاً من أشكال البنية الرباعية ، بما في ذلك الميل الضعيف لبروتين Aequorea الأخضر الفلوري (GFP) إلى التضاؤل ​​، وإلزام dimerization Renilla GFP ، وإلزام tetramerization من البروتين الفلوري الأحمر من Discosoma (DsRed) . على الرغم من أن التباين الضعيف لـ Aequorea GFP لم يعرقل قبوله كأداة لا غنى عنها لبيولوجيا الخلية ، إلا أن عملية التحويل الرباعي الإلزامية لـ DsRed أعاقت بشكل كبير استخدامها كعلامة اندماج مشفر وراثيًا. نقدم هنا التطور التدريجي لـ DsRed إلى ديمر ثم إما إلى اندماج جيني لنسختين من البروتين ، أي ، ثنائي ترادفي ، أو مونومر حقيقي معين mRFP1 (بروتين فلورسنت أحمر أحادي). تعطلت كل واجهة وحدة فرعية عن طريق إدخال الأرجينين ، مما أدى في البداية إلى شل البروتين الناتج ، ولكن يمكن إنقاذ التألق الأحمر عن طريق الطفرات العشوائية والموجهة التي يبلغ مجموعها 17 بديلاً في dimer و 33 في mRFP1. شكلت اندماج بروتين مفرق الفجوة connexin43 إلى mRFP1 تقاطعات تعمل بكامل طاقتها ، بينما فشلت عمليات الاندماج المماثلة لـ tetramer و dimer. على الرغم من أن mRFP1 لديه معامل انقراض أقل إلى حد ما ، وعائد كمي ، واستقرار ضوئي من DsRed ، فإن mRFP1 ينضج و gt 10 مرات أسرع ، بحيث يظهر سطوعًا مشابهًا في الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ذروة الإثارة والانبعاثات لـ mRFP1 و 584 و 607 نانومتر ، هي عبارة عن تحول أحمر بمقدار 25 نانومتر تقريبًا من DsRed ، مما يمنح تغلغلًا أكبر للأنسجة وفصلًا طيفيًا عن التألق الذاتي والبروتينات الفلورية الأخرى.

الأرقام

تمثيل رسومي للرباعي ، ...

تمثيل رسومي للرباعي ، والثنائي ، والمونومر لـ DsRed على أساس ...

التحليل التحليلي للتنبيذ الفائق لـ DsRed ، ...

تحليل الطرد المركزي الفائق التحليلي لـ DsRed و dimer2 و mRFP0.5a. ملامح الامتصاص الشعاعي للتوازن ...

أطياف الإسفار والامتصاص لـ ...

أطياف الإسفار والامتصاص لـ DsRed ( أ ) ، T1 ( ب ),…

نضوج التألق الأحمر من أجل ...

نضج التألق الأحمر لـ DsRed و T1 و dimer2 و tdimer2 (12) و mRFP1. ثقافات مرحلة اللوغاريتم ...

تنصهر خلايا هيلا التي تعبر عن Cx43 ...

خلايا هيلا التي تعبر عن Cx43 مدمجة مع T1 أو dimer2 أو mRFP1. ( أ ,…


حساب معامل الانقراض لـ GFP - علم الأحياء

كلية الجغرافيا والأرض وعلوم البيئة ، جامعة برمنغهام ، إدجباستون ، برمنغهام ، المملكة المتحدة
بريد الالكتروني: [email protected]

ب قسم الكيمياء ، جامعة كامبريدج ، لينسفيلد رود ، كامبريدج ، المملكة المتحدة

ج مرفق الليزر المركزي ، معمل رذرفورد أبليتون ، هارويل ، أكسفورد ، المملكة المتحدة

د قسم الكيمياء ، إمبريال كوليدج لندن ، حرم ساوث كنسينغتون ، لندن ، المملكة المتحدة

الملخص

بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) هو مسبار الفلوريسنت المستخدم على نطاق واسع في علوم الحياة والعلوم الحيوية نظرًا لارتفاع العائد الكمي ومعامل الانقراض ، وقدرته على الارتباط بالنظم البيولوجية ذات الأهمية. تقيس هذه الدراسة عمر مضان GFP في محاليل السكروز / الماء ذات المولارية المعروفة من أجل تحديد العمر المعتمد على معامل الانكسار لـ GFP. تم فحص مجموعة من مؤشرات الانكسار من 1.43 إلى 1.53 عن طريق ارتفاع قطرات بحجم ميكرون مكونة من الماء / السكروز / GFP في مصيدة بصرية تحت ظروف مقيدة جيدًا من الرطوبة النسبية. يسمح هذا الإعداد لأول قياسات تم الإبلاغ عنها لعمر مضان GFP في مؤشرات الانكسار أكبر من 1.46. النتائج التي تم الحصول عليها بمؤشرات انكسار أقل من 1.46 تظهر توافق جيد مع الدراسات السابقة. سمحت التجارب الإضافية التي احتجزت قطرات من الماء منزوع الأيونات المحتوية على GFP بقياس خصائص استرطابية لـ GFP. وجد أن GFP مسترطب بشكل معتدل بالكتلة ، ولكن النسبة العالية من الكتل الجزيئية لـ GFP إلى الماء (كاليفورنيا. 1500: 1) تشير إلى أن امتصاص الماء كبير على أساس كل مول. تم التحقق من خصائص استرطابية باستخدام التصوير المجهر برايتفيلد ، لقطرات GFP في الرطوبة النسبية المنخفضة والعالية ، عن طريق قياس حجم القطيرة المعتمدة على الرطوبة. بالإضافة إلى ذلك ، سمحت هذه التجربة بتقدير معامل الانكسار لـ GFP النقي لأول مرة (1.72 ± 0.07). يوفر هذا العمل بيانات مرجعية للتجارب المستقبلية التي تنطوي على GFP ، خاصة لتلك التي أجريت في وسط معامل الانكسار العالي. يوضح العمل أيضًا أنه يمكن استخدام GFP كمسبار لدراسات الهباء الجوي ، والتي تتطلب تحديد معامل الانكسار للهباء من أي شكل.


Superfolder GFP

لم تتم إضافة مقتطفات لـ Superfolder GFP
المقتطفات عبارة عن مقتطفات من المنشورات التي تلتقط معلومات أساسية حول هذا البروتين والتي لا تتناسب بسهولة مع أحد الحقول الموجودة (مثل الملخص أو الدافع أو الملاحظة).

المرجع الأساسي

هندسة وتوصيف البروتين الفلوري الأخضر superfolder

(2005). Nature Biotechnology ، 24(1) ، 79-88. دوى: 10.1038 / nbt1172. مقالة منشورة

مراجع إضافية

بروتين فلورسنت أخضر أحادي مستقر للغاية جديد للتصوير الحجمي المباشر للأعضاء بأكملها باستخدام CLARITY

(2018). التقارير العلمية ، 8(1) ، 667. دوى: 10.1038 / s41598-017-18045-y. مقالة منشورة

التوصيف المنهجي لوقت نضج البروتينات الفلورية في الخلايا الحية

(2017). طرق الطبيعة ، 15(1) ، 47-51. دوى: 10.1038 / nmeth.4509. مقالة منشورة

أحداث كيميائية ضوئية مختلفة لأزيد فينيل مشفر وراثيًا تحدد وتعديل مضان GFP

(2013). Angewandte Chemie International Edition 52(23) ، 5974-5977. دوى: 10.1002 / anie.201301490. مقالة منشورة

البيولوجيا التركيبية للبروتينات: ضبط طي GFPs واستقرارها باستخدام الفلوروبرولين

(2008). بلوس وان، 3(2) ، ه 1680. دوى: 10.1371 / journal.pone.0001680. مقالة منشورة

مقارنة بين ديناميكيات الإسفار للجزيئات المفردة لبروتين فلورسنت أخضر: إثارة واحدة مقابل الإثارة ثنائية الفوتون

(2006). ChemPhysChem ، 7(1) ، 250-260. دوى: 10.1002 / cphc.200500247. مقالة منشورة

موارد خارجية

أضف مقتطفًا

يجب عليك تسجيل الدخول لإضافة مقتطفات إلى FPbase

أضف مرجعًا

يجب عليك تسجيل الدخول لإضافة مراجع إلى FPbase

أضف Superfolder GFP إلى مجموعتك

يجب عليك تسجيل الدخول لإنشاء مجموعات البروتين

منشئ عنوان URL لصورة الطيف

يمكن تنزيل الصور الطيفية المولدة ديناميكيًا في مجموعة متنوعة من التنسيقات أو تضمينها في مكان آخر. يساعد هذا النموذج في بناء معلمات url لاسترداد الصورة الطيفية التي تريدها.


جاميلوس

أظهر Gamillus المعبر عنه في خلايا هيلا أيضًا انخفاضًا ضوئيًا في التألق إلى ∼60 ٪ أو 10 ٪ من شدته الأولية عن طريق الإثارة مع 457-487 نانومتر (نطاق إثارة GFP ، 470 ميغاواط / سم 2 لمدة 40 ثانية) أو 488-512 نانومتر ( مدى الإثارة YFP ، 360 ميجاوات / سم 2 لمدة 40 ثانية) ضوء قوس الزئبق ، على التوالي. تم استرداد الكثافة المنخفضة عن طريق التشعيع اللاحق باستخدام ضوء 352-388 نانومتر (770 ميغاواط / سم 2 لمدة 10 ثوانٍ). على النقيض من ذلك ، كانت تغيرات شدة التألق المعتمدة على الوقت ضئيلة للغاية باستخدام ضوء إثارة 440-480 نانومتر لأنه يُفترض أنه يجعل التوازن الفوتوكرومي لـ جاميلوس المهيمن في الحالة الأيونية.

شينودا وآخرون (2018)

أحد الأسباب المحتملة للضوء الفوتوكرومي المهم هو معدل تشغيل أعلى بكثير ، مقارنة بمعدل التبديل. في تقديرنا ، معدل التبديل هو

200 ضعف أعلى من التبديل بإضاءة ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر ، بنفس كثافة الطاقة. لتبسيط التصوير ، اخترنا إضاءة 440-480 نانومتر للحد من الظواهر اللونية. في ظل هذا النطاق الموجي للإثارة ، يكون السطوع في المختبر لـ جاميلوس (محسوبًا على أنه ناتج متوسط ​​معاملات الانقراض التي تزيد عن 440-480 نانومتر [ɛ440-480] والعائد الكمي) هو 98 ٪ من معامل الانقراض EGFP (ɛ440-480 لـ جاميلوس و EGFP كانت 28.8 و 35.4 ملي مولار 1 سم ، على التوالي)


[. ] من أجل تحديد تركيزات البروتينات المختلفة ، استخدم هذا التحقيق عدة فحوصات ، كطريقة لإعداد وتحليل عينات البروتين. يعتمد اختبار Coomassie Blue على التفاعلات اللونية ، بين المركبات الإضافية وتحليل البروتين. تسمح هذه التقنية للعينات ذات الامتصاصية الضئيلة أو المعدومة بأن تصبح & ldquovisible & rdquo إما عن طريق تغيير المكون كيميائيًا ، أو إنتاج مركبات بديلة بكميات متناسبة. (Congdon ، وآخرون 1993) غالبًا ما يتم استخدام هذه التقنية المستخدمة بشكل كبير لسهولة استخدامها ، فضلاً عن حساسيتها العالية للتحليل. [. ]

[. ] يمكن تفسير هذا التناقض ببساطة من خلال مسألة الوقت المنقضي لرد الفعل. تستخدم المقايسات اللونية تفاعل المكونات لتكشف أساسًا عن مركب في المحلول. إذا لم يتم تشغيل هذا التفاعل حتى الاكتمال ، فقد تكون القيم التي تم الحصول عليها غير دقيقة ، حيث تتطلب التركيزات المنخفضة وقتًا أطول بكثير للتفاعل. (جور ، 2000) قد يفسر هذا الشرط أوجه القصور الملحوظة ، ولكنه قد يكون أيضًا مرتبطًا على وجه التحديد بممارسات أخذ العينات السيئة وإدراج المركبات الأجنبية. يبدو أن الاختلافات في طول المسار تتبع اتجاهًا مشابهًا ، حيث يجب أن يؤدي طول المسار المتزايد إلى زيادة الامتصاصية المولارية. [. ]

[. ] معاملات الانقراض المحسوبة لبروتينات BSA و Gamma Globulin عن طريق الامتصاص الطيفي لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية قياس امتصاص البروتين تركيز امتصاص المسار الانقراض متوسط ​​الطول الموجي n (ug / ml) الطول E-Coef. معامل حساب العينة: معامل الانقراض بير لامبرت: الامتصاص = (معامل الانقراض) (التركيز) (طول المسار) 0.608 = E (600 ميكروغرام / مل) (1 سم) E = 0.608 / 600 ميكروغرام / مل = 0.00101 الشكل 03 . المنحنيات المعيارية لبروتينات BSA و Gamma Globulin المشتقة عن طريق التحليل الطيفي لمقايسة Lowry الجدول 04. قيم تركيز البروتين المقحمة عن طريق توحيد BSA البروتين المخفف مقايسة الامتصاص المخفف متوسط ​​تركيز التركيز (ميكروغرام / مل) العامل n (ميكروغرام / مل) n (ميكروغرام / مل) خط أزرق أزرق لين أزرق أزرق أزرق لين لين لين جدول محرف قيم تركيز البروتين عن طريق توحيد غاما غلوبولين مقايسة امتصاص البروتين المخفف متوسط ​​تركيز تركيز مخزون المخفف n (ميكروغرام / مل) n (ميكروغرام / مل) n (ميكروغرام / مل) / مل) (ميكروغرام / مل) أزرق لين أزرق لين أزرق أزرق لين لين لين جدول 06. [. ]

[. ] (هاريس ، 2007) مع تطبيق المسافة والامتصاصية ، يمكن أن يكون الامتصاص متناسبًا مع تركيزات المركبات المختلفة في المحلول. تعتمد هذه العلاقة ، التي حددها قانون بير لامبرت ، على مبدأين أساسيين. عندما يمر الضوء عبر عينة ، يتم امتصاصه بشكل متناسب عبر الوسط بأكمله ، وبالتالي يكون مستقلاً عن الطيف التجريبي. ثانيًا ، ترتبط كمية الضوء التي تمتصها العينة مباشرة بكمية جزيئات التحليل الموجودة في المحلول. (جور ، 2000) يعني هذا التفاعل أنه كلما زاد عدد الجزيئات داخل العينة (التركيز) ، يزداد الامتصاص الكلي للضوء. [. ]

[. ] كل بروتين تراوحت قيمته بما يزيد عن 1000 ميكروغرام / مل ، مما يشير إلى وجود عيب كبير في التصميم في التحليل. أدى معيار جاما-جلوبيولين إلى تقلب عام أقل ، على الرغم من أنه لم يكن ضمن المستويات المقبولة. 500 ميكروغرام / مل) (الجدول 05) قدم بروتين الهيموجلوبين أيضًا انحرافًا منفصلاً بشكل خاص عن البروتينات الأخرى. كما ذكرنا سابقًا ، فإن القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية عرضة لتضمين جزيئات متداخلة. تمتص جزيئات مثل الأكسجين بسهولة الأشعة فوق البنفسجية ، ويمكن أن تؤدي إلى تحريف النتائج. (Aitken & Learmonth ، 2002) يحتوي الهيموجلوبين على مكونات حديدية ، وبالتالي يتفاعل لربط الأكسجين بالدم. [. ]


مراجع

Zorman، S.، Botte، M.، Jiang، Q.، Collinson، I. & amp Schaffitzel، C. التطورات والتحديات المتعلقة بإنتاج مركب غشاء البروتين. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 32, 123–130 (2015).

عبد الرسول ، A. ، Doan ، H. & amp Lohi ، A. in أغشية المحاكاة الحيوية والأغشية الحيوية لآفاق جديدة في تكنولوجيا معالجة المياه المستدامة (IntechOpen ، 2017).

Caffrey، M. مراجعة شاملة لمرحلة تكعيب الدهون أو بالطريقة المتوسطة لبلورة الغشاء والبروتينات والمجمعات القابلة للذوبان. اكتا Crystallogr. F. الهيكل. بيول. كومون. 71, 3–18 (2015).

باركر ، J.L & amp Newstead ، S. تبلور بروتين الغشاء: الاتجاهات الحالية ووجهات النظر المستقبلية. حال. إكسب. ميد. بيول. 922, 61–72 (2016).

كاربنتر ، إي بي ، بيس ، ك. ، كاميرون ، إيه دي وأمبير إيواتا ، إس. التغلب على تحديات علم بلورات البروتين الغشائي. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 18, 581–586 (2008).

Danev، R.، Yanagisawa، H. & amp Kikkawa، M. منهجية المجهر الإلكتروني بالتبريد: الجوانب الحالية والاتجاهات المستقبلية. اتجاهات Biochem. علوم. 44, 837–848 (2019).

Garcia-Nafria، J. & amp Tate، C.G. Cryo-Electron microscopy: تجاوز الهياكل البلورية للأشعة السينية لمستقبلات الأدوية وتطوير الأدوية. Annu. القس فارماكول. توكسيكول. 60, 51–71 (2020).

Cheng ، Y. البيولوجيا الهيكلية لبروتين الغشاء في عصر الجسيمات المفردة cryo-EM. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 52, 58–63 (2018).

Sjostrand ، D. ، Diamanti ، R. ، Lundgren ، C. A. K. ، Wiseman ، B. & amp Hogbom ، M. بروتوكول فحص حالة التعبير والتنقية للبيولوجيا الهيكلية لبروتين الغشاء. علوم البروتين. 26, 1653–1666 (2017).

ما ، ب وآخرون. استراتيجية فعالة للفحص على نطاق صغير وإنتاج بروتينات نقل الغشاء البدائي في الإشريكية القولونية. بلوس واحد 8، e76913 (2013).

Lluis، M. W.، Godfroy، J. I. 3rd & amp Yin، H. طرق هندسة البروتين المطبقة على أهداف بروتين الغشاء. هندسة البروتين. ديس. سيل. 26, 91–100 (2013).

شوتز ، إم وآخرون. التطور الموجه للمستقبلات المقترنة بالبروتين G في الخميرة لإنتاج وظيفي أعلى في مضيفات التعبير حقيقية النواة. علوم. اعادة عد. 6, 21508 (2016).

Eshaghi، S. et al. استراتيجية فعالة لفحص التعبير عالي الإنتاجية لبروتينات الغشاء المتكامل المؤتلف. علوم البروتين. 14, 676–683 (2005).

Cai ، H. ، Yao ، H. ، Li ، T. ، Tang ، Y. & amp Li ، D. بيتشيا باستوريس. البروتين Expr. بوريف. 164, 105463 (2019).

جنسن ، H. M. ، Eng ، T. ، Chubukov ، V. ، Herbert ، R. A. & amp Mukhopadhyay ، A. تحسين تعبير بروتين الغشاء ووظيفته باستخدام التعديلات الجينية. علوم. اعادة عد. 7, 13030 (2017).

Bernaudat، F. et al. تعبير غير متجانس عن بروتينات الغشاء: اختيار المضيف المناسب. بلوس واحد 6، e29191 (2011).

Freigassner، M.، Pichler، H. & amp Glieder، A. ضبط العوائل الميكروبية لإنتاج بروتين الغشاء. ميكروب. حقيقة الخلية. 8, 69 (2009).

بيل ، آر إم ، لعب اللحاق بالركب الإشريكية القولونية: استخدام الخميرة لزيادة معدلات النجاح في تجارب إنتاج البروتين المؤتلف. أمام. ميكروبيول. 5, 85 (2014).

Parker، J.L & amp Newstead، S. طريقة لزيادة محصول تعبير بروتين غشاء حقيقيات النواة في خميرة الخميرة للدراسات الهيكلية والوظيفية. علوم البروتين. 23, 1309–1314 (2014).

Schlegel، S. et al. إحداث ثورة في إفراز البروتين الغشائي في البكتيريا. ميكروب. التكنولوجيا الحيوية. 3, 403–411 (2010).

ديلورث ، إم في وآخرون. أنظمة التعبير الجرثومية لبروتينات الغشاء. أساليب 147, 3–39 (2018).

واجنر ، إس وآخرون. ضبط الإشريكية القولونية لفرط بروتين الغشاء. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105, 14371–14376 (2008).

تشانغ ، زد وآخرون. إنتاج عالي المستوى لبروتينات الغشاء في بكتريا قولونية BL21 (DE3) عن طريق حذف المحفز IPTG. ميكروب. حقيقة الخلية. 14, 142 (2015).

Jia ، B. & amp Jeon ، C.O. تعبير البروتين المؤتلف عالي الإنتاجية في الإشريكية القولونية: الوضع الحالي والآفاق المستقبلية. افتح بيول. 6, 160196 (2016).

روتليدج ، إس جيه وآخرون. تخليق بروتينات الغشاء المؤتلف في الخميرة للدراسات الهيكلية. أساليب 95, 26–37 (2016).

هنتر ، إم ، يوان ، ب. ، فافيلالا ، د. & أمبير فوكس ، إم. تحسين التعبير البروتيني في خلايا الثدييات. بالعملة. بروتوك. علوم البروتين. 95، e77 (2019).

درو ، د. وآخرون. مخطط التحسين القائم على GFP للإفراط في التعبير وتنقية بروتينات الغشاء حقيقية النواة في خميرة الخميرة. نات. بروتوك. 3, 784–798 (2008).

شيباتا ، واي وآخرون. التثبيت الحراري لمستقبلات نيوروتنسين NTS1. جيه مول. بيول. 390, 262–277 (2009).

Magnani ، F. ، Shibata ، Y. ، Serrano-Vega ، M.J & amp Tate ، C.G. الاستقرار المتطور المشترك والتجانس المطابق للأدينوزين البشري A2 أ مستقبل. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105, 10744–10749 (2008).

روبرتسون ، ن. وآخرون. خصائص المستقبلات المقترنة بالبروتين G المستقرة حرارياً (StaRs) واستخدامها في اكتشاف الأدوية. علم الادوية العصبية 60, 36–44 (2011).

Heydenreich، F.M، Vuckovic، Z.، Matkovic، M. & amp Veprintsev، D.B. تثبيت مستقبلات البروتين G عن طريق الطفرات النقطية. أمام. فارماكول. 6, 82 (2015).

شاو ، زد وآخرون. هيكل بلوري عالي الدقة لمستقبلات القنب CB1 البشري. طبيعة سجية 540, 602–606 (2016).

هوا ، ت. وآخرون. التركيب البلوري لمستقبلات القنب البشري CB1. زنزانة 167, 750–762 (2016).

Stauch ، B. وآخرون. الأساس الهيكلي للتعرف على الترابط في مستقبل الميلاتونين MT1 البشري. طبيعة سجية 569, 284–288 (2019).

جوهانسون ، إل سي وآخرون. تكشف هياكل XFEL لمستقبلات الميلاتونين البشري MT2 عن أساس انتقائية النوع الفرعي. طبيعة سجية 569, 289–292 (2019).

Eshaghi، S. تعبير عالي الإنتاجية وفحص المنظفات لبروتينات الغشاء المتكاملة. طرق مول. بيول. 498, 265–271 (2009).

كوتوف ، ف.آخرون. فحص استقرار عالي الإنتاجية لبروتينات الغشاء التي تذوب في المنظفات. علوم. اعادة عد. 9, 10379 (2019).

Desuzinges Mandon، E.، Agez، M.، Pellegrin، R.، Igonet، S. & amp Jawhari، A. طريقة جديدة لفحص المنظفات المنهجية لإذابة بروتينات الغشاء. شرجي. بيوتشيم. 517, 40–49 (2017).

شيميزو وآخرون. فحص المنظفات لإذابة البروتينات الغشائية وتنقيتها وبلورتها: دراسة حالة عن السكسينات: أوبيكوينون أوكسيريدوكتاز من الإشريكية القولونية. اكتا Crystallogr. الطائفة. F. الهيكل. بيول. كريست. كومون. 64, 858–862 (2008).

لينوار ، ج. وآخرون. فحص المنظفات لتثبيت بروتينات الغشاء الوظيفي. بالعملة. بروتوك. علوم البروتين. 93، e59 (2018).

Urner، L.H et al. تقوم المنظفات المعيارية بتخصيص التنقية والتحليل الهيكلي لبروتينات الغشاء بما في ذلك المستقبلات المقترنة ببروتين G. نات. كومون. 11, 564 (2020).

Henrich، E.، Dotsch، V. & amp Bernhard، F. فحص الاحتياجات الدهنية لبروتينات الغشاء من خلال الجمع بين التعبير الخالي من الخلايا والأقراص النانوية. طرق الانزيم. 556, 351–369 (2015).

Nji، E.، Chatzikyriakidou، Y.، Landreh، M. & amp Drew، D. تكشف شاشة التحول الحراري المصممة هندسيًا عن تفضيلات الدهون المحددة لبروتينات الغشاء حقيقية النواة وبدائية النواة. نات. كومون. 9, 4253 (2018).

بولوك ، ن.ل وآخرون. تحسين استقرار ووظيفة ABCB1 و ABCA4 المنقى: تأثير الدهون الغشائية. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1838, 134–147 (2014).

Reyes-Alcaraz، A.، Martinez-Archundia، M.، Ramon، E. & amp Garriga، P. تأثيرات الملح على الاستقرار التوافقي للمستقبل المرئي G- البروتين المقترن رودوبسين. بيوفيز. ج. 101, 2798–2806 (2011).

Hattori، M.، Hibbs، R. E. & amp Gouaux، E. A مقايسة الاستبعاد بالحرارة المعتمدة على اللوني للكشف عن التألق لفحص تبلور البروتين الغشائي. بنية 20, 1293–1299 (2012).

نيوباي ، زد إي وآخرون. بروتوكول عام لبلورة البروتينات الغشائية للفحص الإنشائي بالأشعة السينية. نات. بروتوك. 4, 619–637 (2009).

Mancusso، R.، Karpowich، N.K، Czyzewski، B. K. & amp Wang، D.N. طريقة فحص بسيطة لتحسين ثبات البروتين الغشائي. أساليب 55, 324–329 (2011).

كارلسون ، إم إل وآخرون. Peptidisc ، طريقة بسيطة لتثبيت بروتينات الغشاء في محلول خالي من المنظفات. eLife 7، pii: e34085 (2018).

درو ، د. وآخرون. خط أنابيب قابل للتطوير يعتمد على GFP لفحص البروتين الغشائي وتنقيته. علوم البروتين. 14, 2011–2017 (2005).

لي ، سي إتش وآخرون. تكشف هياكل مستقبلات NMDA عن ترتيب الوحدة الفرعية وبنية المسام. طبيعة سجية 511, 191–197 (2014).

Chen، L.، Durr، K. L. & amp Gouaux، E. تراكيب الأشعة السينية لمجمعات السموم الحلزونية لمستقبلات AMPA تضيء آلية التنشيط. علم 345, 1021–1026 (2014).

شيهويا ، دبليو وآخرون. آلية تفعيل مستقبلات الإندوثيلين ETB بواسطة endothelin-1. طبيعة سجية 537, 363–368 (2016).

كين ، ج. ، بورتولاتو ، أ ، هولينشتاين ، ك ، مارشال ، إف إتش ، وأمبير جازايري ، أ. علوم. اعادة عد. 5, 11954 (2015).

I. Kurganov ، B. تمسخ وتحاليل التجميع في الكيمياء الحيوية التحليلية. بيوتشيم. شرجي. بيوتشيم. 2، e143 (2013).

Karasawa، S.، Araki، T.، Yamamoto-Hino، M. & amp Miyawaki، A. Galaxeidae المرجان ونسخته الأحادية للاستخدام في وضع العلامات الفلورية. J. بيول. تشيم. 278, 34167–34171 (2003).

Kiss، C.، Temirov، J.، Chasteen، L.، Waldo، G. S. & amp Bradbury، A.R. هندسة البروتين. ديس. سيل. 22, 313–323 (2009).

وثيقة ، دي دبليو وآخرون. بروتين أخضر حراري ، بروتين فلوري غير متراكم ومستقر للغاية تم إنشاؤه بواسطة هندسة السطح الموجهة بالبنية. البروتينات 83, 1225–1237 (2015).

زيمرمان ، آي وآخرون. الأجسام المضادة أحادية المجال الاصطناعية من أجل الاصطياد التوافقي لبروتينات الغشاء. إليفي 7، بيي: e34317 (2018).

Kawate، T. & amp Gouaux، E. كروماتوجرافيا استبعاد الحجم - الكشف عن التألق لفحص ما قبل التبلور لبروتينات الغشاء المتكاملة. بنية 14, 673–681 (2006).

كاتو ، إتش إي وآخرون. التحولات التوافقية لمركب مستقبلات نيوروتنسين 1-Gi1. طبيعة سجية 572, 80–85 (2019).

هو ، إن جيه وآخرون. فحص التعبير المعتمد على GFP لبروتينات الغشاء في خلايا الحشرات باستخدام نظام baculovirus. طرق مول. بيول. 1261, 197–209 (2015).

Goehring، A. et al. الفحص والتعبير الواسع النطاق لبروتينات الغشاء في خلايا الثدييات للدراسات الهيكلية. نات. بروتوك. 9, 2574–2585 (2014).

Yao ، H. ، Cai ، H. & amp Li ، D. التثبيت الحراري لبروتينات الغشاء عن طريق طفرة إجماع: دراسة حالة لإيزوميراز دلتا 8-7 فطري. جيه مول. بيول. 432, 5162–5183 (2020).

لي ، زد وآخرون. رؤى هيكلية في الخطوة الملتزمة بالتخليق الحيوي للفوسفوليبيد البكتيري. نات. كومون. 8, 1691 (2017).

Rana ، M. S. ، Wang ، X. & amp Banerjee ، A. استراتيجية محسنة لوضع العلامات الفلورية لبروتينات الغشاء من أجل الإفراط في التعبير والتنقية في خلايا الثدييات. الكيمياء الحيوية 57, 6741–6751 (2018).

Kubala ، M.H ، Kovtun ، O. ، Alexandrov ، K. & amp Collins ، B. M. التحليل الهيكلي والديناميكي الحراري لـ GFP: مجمع GFP-nanobody. علوم البروتين. 19, 2389–2401 (2010).

كيرشوفر ، إيه وآخرون. تعديل خصائص البروتين في الخلايا الحية باستخدام الأجسام النانوية. نات. هيكل. مول. بيول. 17, 133–138 (2010).

هانسن ، إس وآخرون. تصميم وتطبيقات مشبك للبروتين الأخضر الفلوري ذي التقارب البيكومولار. علوم. اعادة عد. 7, 16292 (2017).

Whicher، J.R & amp Mackinnon، R. هيكل قناة K + الموصلة بالجهد يكشف عن آلية بديلة لاستشعار الجهد. علم 353, 664–669 (2016).

Park، E.، Campbell، E.B & amp MacKinnon، R. هيكل قناة أيون كلوريد CLC عن طريق الفحص المجهري للبرودة الإلكترونية. طبيعة سجية 541, 500–505 (2017).

Tao، X.، Hite، R.K & amp MacKinnon، R. Cryo-EM بنية القناة K + النشطة عالية التوصيل Ca 2+. طبيعة سجية 541, 46–51 (2017).

دانج ، إس وآخرون. هياكل Cryo-EM لقناة كلوريد الكالسيوم المنشط TMEM16A. طبيعة سجية 552, 426–429 (2017).

Lee، C.H & amp MacKinnon، R. هياكل القناة البشرية المفعلة بفرط الاستقطاب HCN1. زنزانة 168, 111–120 (2017).

Jojoa-Cruz، S. et al. هيكل Cryo-EM للقناة الأيونية المنشط ميكانيكيًا OSCA1.2. eLife 7، بيي: e41845 (2018).

فرايدي ، بي سي وآخرون. خط أنابيب قوي للإنتاج السريع للذخيرة النانوية متعددة الاستخدامات. نات. أساليب 11, 1253–1260 (2014).

Zhang ، Z. ، Wang ، Y. ، Ding ، Y. & amp Hattori ، M. الهندسة القائمة على الهيكل من ترادفات الأجسام النانوية المضادة لـ GFP ككاشفات فائقة التقارب للتنقية. علوم. اعادة عد. 10, 6239 (2020).

هوتر ، سي أ.جيه وآخرون. تشكل البوابة خارج الخلية ملف الطاقة لمصدر ABC. نات. كومون. 10, 2260 (2019).

Krissinel ، E. & amp Henrick ، ​​K. استنتاج التجميعات الجزيئية من الحالة البلورية. جيه مول. بيول. 372, 774–797 (2007).

مورو ، م.ج.ج وآخرون. التحديد السريع لاستقرار البروتين والربط الترابطي عن طريق المسح التفاضلي الفلوري للبروتينات الموسومة بـ GFP. RSC Adv. 2, 11892–11900 (2012).

Jin ، F. ، Wang ، Y. ، Wang ، M. ، Sun ، M. & amp Hattori ، M. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.09.28.316307 (2020).

جاو ، واي وآخرون. مجمعات SNARE العصبية المفردة المعاد تشكيلها سحاب في ثلاث مراحل متميزة. علم 337, 1340–1343 (2012).

Brune، M.، Hunter، J.L، Corrie، J.E & amp Webb، M.R Direct، Real-time القياس لإطلاق الفوسفات غير العضوي السريع باستخدام مسبار الفلورسنت الجديد وتطبيقه على الجزء الفرعي 1 ATPase من الأكتوموسين. الكيمياء الحيوية 33, 8262–8271 (1994).

Tang، Y. & amp Li، D. تطوير مقايسة عالية الإنتاجية لغشاء الجلسرين 3-فوسفات أسيل ترانسفيراز المتكامل. فحص. تطوير المخدرات. تكنول. 17, 267–274 (2019).

كابش ، دبليو إكس دي إس. اكتا Crystallogr. د. بيول. بلوريلوجر. 66, 125–132 (2010).

Evans، P.R & amp Murshudov، G.N. ما مدى جودة بياناتي وما هو الدقة؟ اكتا Crystallogr. د. بيول. بلوريلوجر. 69, 1204–1214 (2013).

مكوي ، أ.جيه وآخرون. برنامج علم البلورات فيزر. J. أبل. بلوريلوجر. 40, 658–674 (2007).

Emsley، P.، Lohkamp، B.، Scott، W.G & amp Cowtan، K. ميزات وتطوير Coot. اكتا Crystallogr. د. بيول. بلوريلوجر. 66, 486–501 (2010).

آدامز ، بي دي وآخرون. PHENIX: نظام شامل قائم على Python لحل البنية الجزيئية. اكتا Crystallogr. د. بيول. بلوريلوجر. 66, 213–221 (2010).

شرودنجر ، إل. نظام الرسوميات الجزيئية PyMOL ، الإصدار 1.8. https://pymol.org (2015).

Hanner، M. et al. Phenylalkylamine Ca2 + بروتين ملزم مضاد. الاستنساخ الجزيئي وتوزيع الأنسجة والتعبير غير المتجانسة. J. بيول. تشيم. 270, 7551–7557 (1995).


البروتين الفلوري الأخضر - مثال مقال

ينتج عن ذلك عدد كبير من التحولات الكيميائية حيث يشكل الجلايسين رابطة كيميائية مع السيرين ، ونتيجة لذلك تتشكل حلقة مغلقة جديدة ، ويتبع العملية الجفاف. في الساعة التالية ، يتفاعل الأكسجين البيئي مع الرابطة الموجودة في التيروزين مما يؤدي إلى تكوين رابطة مزدوجة لتشكيل حامل كروموفوري جديد. يعتبر GFP مثاليًا للهندسة الوراثية لأنه يحتوي على كروموفور خاص به. يتم توفير التعليمات الجينية للخلية قيد التحقيق ، والتي تبني في النهاية بروتين GFP ، يطوى GFP بطريقة محددة ويتوهج.

تتضمن الدراسات البحثية المختلفة GFP كجزيء مراسل لفهم عمل الجينات أو الجزيئات بطريقة صريحة. البروتين الفلوري الأخضر (GFP) هو جزيء بروتين تم إنشاؤه بواسطة قنديل البحر Aequorea victoria. يعرض الكائن الحي بروتينه الفلوري على طول حافة مظلته كنقاط متوهجة للضوء. يتم إنشاء الضوء من كتل الأنسجة الصفراء التي تشمل ما يقرب من 6000-7000 خلية ضوئية. تنتج هذه الخلايا الضوئية الضوء عن طريق التلألؤ الحيوي ، بما في ذلك البروتين الضوئي المنشط بالكالسيوم ، المعروف باسم "aequorin" الذي ينتج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والضوء الأزرق والأخضر.

يقبل GFP الطاقة من جزيء البروتين aequorin ويعطيها كضوء أخضر (Green Fluorescent Protein ، n.d.). يتكون GFP من 238 من الأحماض الأمينية في البروتين. يظل البروتين مستقرًا بدرجة عالية في محاليل محايدة حتى عند درجة حرارة 65 درجة مئوية. كما أن GFP مستقر أيضًا في نطاق الأس الهيدروجيني الأوسع من 5.5 إلى 12. جزيء البروتين لـ GFP متوهج بقوة ، مع فعالية كمية تبلغ حوالي 80 في المائة بالإضافة إلى معامل الانقراض المولي البالغ 2.2 × 104 سم -1 م -1. الحد الأقصى للوميض الذي يعرضه GFP هو 400 نانومتر بينما يتم عرض ذروة أقل عند 475 نانومتر ، بينما يتم عرض ذروة انبعاث الأسفار عند 509 نانومتر.

يُعزى التألق الجوهري لـ GFP إلى الكروموفور المرتبط تساهميًا الحصري ، وهو


شاهد الفيديو: calculation of extinction coefficient from absorbance (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Jibril

    أعني أنك لست على حق. يمكنني الدفاع عن موقفي.

  2. Mikagul

    برافو ، هذا الفكر الممتاز يجب أن يكون عن قصد بالضبط



اكتب رسالة