معلومة

14: SDS-PAGE - علم الأحياء

14: SDS-PAGE - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

سيقدم لك هذا المعمل SDS-PAGE ، وهي طريقة بسيطة وغير مكلفة لحل البروتينات في الخلائط المعقدة.
توفر المواد الهلامية SDS-PAGE المواد الأولية للبقع الغربية وللبعض التقنيات البروتينية. في هذا المختبر ، ستفعل
استخدم SDS- PAGE لتحليل مستخلصات البروتين التي أعددتها من سلالات الخميرة المفرطة في التعبير عن انصهار Met و LacZ
البروتينات.


أهداف

في نهاية هذا المعمل ، سيتمكن الطلاب من:

  • مناقشة المبادئ التي تحكم فصل البروتين على المواد الهلامية SDS- PAGE المتقطع.
  • صب وتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE.
  • تحليل نمط العصابات على هلام SDS-PAGE ملون
  • تقدير الوزن الجزيئي للبروتين من هجرته على المواد الهلامية SDS-PAGE

سيقدم لك هذا المعمل SDS-PAGE (كبريتات دوديسيل الصوديوم - رحلان جل بولي أكريلاميد الكهربي) ، وهي طريقة بسيطة وغير مكلفة لحل البروتينات في الخلائط المعقدة. ستستخدم المواد الهلامية SDS-PAGE لتحليل مستخلصات بروتين الخميرة التي أعددتها في المعمل الأخير. سيقوم كل فريق بصنع نوعين من المواد الهلامية. سيتم تلوين جل واحد باستخدام Simply Blue لتصور جميع البروتينات الموجودة في المستخلصات. سيتم استخدام الجل الثاني للبقع الغربية (الفصل 15) الذي سيكشف بشكل خاص عن بروتينات الانصهار Met و LacZ في المستخلصات.


حجم البروتين ونسبة الجل - (26 نوفمبر 2009)

مرحبًا بالجميع & # 33
هل يمكن لأي شخص أن يساعدني في العثور على مرجع للإرشادات حول نسبة الهلام التي يجب استخدامها فيما يتعلق بأحجام البروتينات التي يجب حلها في SDS-PAGE ولماذا؟ بعبارة أخرى ، لا بد لي من إثبات رئيسي من خلال الإشارة المحترمة إلى أنه ليس من المقبول استخدام SDS-PAGE عند 4-12٪ لرؤية بروتين (بعد تلطيخ الغرب وتلطيخ الجسم المضاد) بكتلة جزيئية محسوبة تبلغ 14 كيلو دالتون (على الرغم من أنه يعمل عادةً بالقرب من 16 كيلو دالتون). أحاول إقناعها بأن 15٪ أفضل وأن البروتين يجب أن يكون في منتصف الهلام وليس في النهاية ، بينما تقول إنني إذا أوقفت PAGE في وقت جيد (قبل أن تنفد الصبغة من الجل) ، فهذا مقبول . المشكلة الأساسية هي أنه بالنسبة لبعض resasons التي لا أعرفها ، يبدو الغربيون من 4-12٪ و 15٪ مختلفين ، في حين أنها تحب أكثر من 4-12٪ لأنها تتناسب مع نظريتها بينما 15٪-do & # 39t.
شكرا جزيلا للمساعدة # 33
ملاحظة. لا أعتقد أنني لم أحاول العثور عليه بنفسي. شكرا مرة أخرى & # 33

سيبدو الغرب مختلفًا حيث يوجد تدرج في حجم المسام. سوف ينتقل الجزيء في 4-12٪ منه في 15٪ حيث يكون حجم المسام أكبر في بداية هلام الحل & # 33 & # 33 & # 33
لكن بالنسبة لبروتين 14 كيلو دالتون 4-12 ليس خيارًا جيدًا .. يمكنك في الواقع تجربة تدرج 8-20 أو اختيار 15٪ أفضل .. النقطة الأساسية هي أن تكون قادرًا على رؤية شوائب HMwt و LMwt Impuriteis بدقة جيدة & # 33 & # 33 & # 33
أتساءل لماذا يكون PI الخاص بك عنيدًا للغاية في هذه الحقيقة العلمية البسيطة & # 33 & # 33 & # 33
حظًا سعيدًا لك على الرغم من & # 33 & # 33 & # 33

مرحبًا & # 33
هل لديك أية مراجع؟ هي عالمة مناعة (لا يوجد دليل عن الكيمياء الحيوية) والنوع الذي يثق فقط في بعض المراجع وليس فقط كلماتي. شكر & # 33
لا يبدو الأمر مختلفًا بالنسبة إلى الغربيين فقط: فمجموعة الاهتمام ، التي لا تراها عند 4-12٪ ، تظهر بنسبة 15٪ (يتعلق الأمر بالعينات المعالجة وغير المعالجة). هذا الأخير هو ما لا تحبه ، لأنه يتعارض مع نظريتها.

قال Pradeep Iyer في 26 تشرين الثاني (نوفمبر) 2009 ، الساعة 12 & # 5800 مساءً:

أنا أفهم .. يمكنك أن تبين لها حجم الاستنساخ الجزيئي sambrook 3 .. أنها تعطي الأحجام والنسب المئوية للمواد الهلامية لاستخدامها. لكني أخشى أن النسبة المئوية المثالية للتدرج لن يتم إعطاؤها هناك وهو اكتشاف نادر .. لا يزال إذا جئت عبر أحد سينشره. ولكن يمكن أن تكون النسبة المتجانسة مفيدة في sambrook والعديد من المواقع على الإنترنت أيضًا & # 33 & # 33 & # 33

من الواضح هنا أنه لا يمكن استخدام 4-12 لجزيء 14 كيلو دالتون. هذه الهزة تكون كافية لإغلاق PI الخاص بك على ما أعتقد. إنه على موقع المخمرات & # 33 & # 33
بروتوكولات التطبيق - التحليل الكهربائي وتحليل البروتين - SDS-PAGE

نطاق البروتين ميغاواط ، الجل الموصى به كيلو دالتون ،٪

100-400 4 %
نطاق البروتين ميغاواط ، هلام التدرج الموصى به كيلو دالتون ،٪

شكرًا جزيلاً على هذه المعلومات & # 33 & # 39 لقد كنت أحاول العثور عليها & # 33 & # 33 & # 33
لذلك ، كنت أقوم بعمل لطخة غربية لبروتين 8.7 كيلو دالتون في جل 4-12٪ Bis-Tris وقد تمكنت من اكتشافه.

قال Pradeep Iyer في 26 تشرين الثاني (نوفمبر) 2009 ، الساعة 05 & # 5850 صباحًا:

من الواضح هنا أنه لا يمكن استخدام 4-12 لجزيء 14 كيلو دالتون. هذه الهزة تكون كافية لإغلاق PI الخاص بك على ما أعتقد. إنه على موقع المخمرات & # 33 & # 33
بروتوكولات التطبيق - التحليل الكهربائي وتحليل البروتين - SDS-PAGE

نطاق البروتين ميغاواط ، الجل الموصى به كيلو دالتون ،٪

100-400 4 %
نطاق البروتين ميغاواط ، هلام التدرج الموصى به كيلو دالتون ،٪


مطياف الكتلة لمراقبة جودة الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية بعد هضم الهلام SDS-PAGE

يتم تضمين الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية المؤتلفة (bsAbs) بشكل متزايد في أنظمة علاج السرطان. مطلوب إجراءات مراقبة الجودة الصارمة المتوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) لضمان جودة وسلامة هذه الكائنات البيولوجية المبتكرة. الرحلان الكهربائي للهلام (الرحلان الكهربائي للهلام دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد الهلام [SDS-PAGE]) وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم (SEC) هما حجر الزاوية في طرق مراقبة الجودة. غالبًا ما تكون BsAbs عرضة للتجميع أو التخليق غير الكامل نظرًا لطبيعتها الاصطناعية. بالإضافة إلى ذلك ، تشكل بروتينات الخلية المضيفة والحمض النووي للخلية المضيفة وكذلك الشوائب من عملية التنقية نفسها ملوثات محتملة. قد تظهر هذه الشوائب بعد ذلك على شكل نطاقات أو قمم إضافية غير متوقعة على المواد الهلامية SDS-PAGE و SEC ، على التوالي. نحن هنا نصف بروتوكول موحد للتحليل السريع للأجسام المضادة المؤتلفة عن طريق قياس الطيف الكتلي (MS) بعد الهضم التجريبي للعصابات المستأصلة من المواد الهلامية SDS-PAGE. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لتوصيف "العصابات الملوثة" غير المتوقعة التي لوحظت أثناء التطوير السريري لـ bsAb جديد بخصوصية PSMAxCD3 ، إما أثناء إنتاج البروتين نفسه أو أثناء تطوير جزيء بديل للتقييم في نماذج الماوس المتزامنة. سمح لنا تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد بتحديد أصل هذه النطاقات بدقة ، والتي نتجت عن المصنوعات اليدوية أو من تخليق البروتين غير المكتمل. وبالتالي ، فإن الاستخدام المشترك لـ SDS-PAGE و MS يمكن أن يدعم بشكل كبير الإنتاج المتوافق مع GMP للبروتينات المؤتلفة.

الكلمات الدالة: SDS PAGE مراقبة جودة قياس الطيف الكتلي للأجسام المضادة ثنائية الخصوصية.

© 2021 المؤلفون. التكنولوجيا الحيوية والهندسة الحيوية التي نشرتها Wiley Periodicals LLC.


المواد الهلامية بولي أكريلاميد لـ SDS-PAGE

تم تطوير العديد من أنظمة الفصل الكهربائي للبروتين ، وتختلف الأجهزة المستخدمة في SDS-PAGE على نطاق واسع. المنهجية المستخدمة في هذه الصفحات تستخدم طريقة اللملي. تُلغي الإشارة إلى طريقة Laemmli في قسم المواد والأساليب الحاجة إلى وصف المخازن المؤقتة ، وصب المواد الهلامية ، والجهاز ، وما إلى ذلك. قسم الطرق هي النسبة المئوية لمجموع الأكريلاميد (٪ T) في مادة هلامية ، والنسبة المئوية النسبية ونوع الرابط المتشابك (٪ C) ، وربما إشارة إلى أبعاد الهلام. نحن نستخدم نظام & quotmini-gel & quot ، مع أشرطة جل 3 1/4 & quot × 4 & quot.

يمكن إجراء SDS-PAGE على المواد الهلامية مسبقة الصب ، مما يوفر مشكلة ومخاطر العمل باستخدام مادة الأكريلاميد. ينطبق الوصف التالي على أجهزة الصب والتشغيل المصنوعة في المتاجر والتي تكون أرخص بكثير من المعدات المتاحة تجاريًا. بالإضافة إلى الفعالية من حيث التكلفة ، فإن ميزة صنع المواد الهلامية في المرة الأولى هي فهم أعمق للعملية.

بغض النظر عن النظام ، يتطلب الإعداد صب طبقتين مختلفتين من مادة الأكريلاميد بين الألواح الزجاجية. الطبقة السفلية (التي تفصل ، أو تحل ، الهلام) مسؤولة عن فصل البولي ببتيدات حسب الحجم. تشتمل الطبقة العليا (جل التراص) على آبار العينة. إنه مصمم لاكتساح البروتينات في عينة بين حدين متحركين بحيث يتم ضغطها (مكدسة) في طبقات رقيقة ميكرومتر عندما تصل إلى هلام الفصل.


انقل باستخدام XCell II Blot Module

تسمح لك وحدة XCell II Blot Module بنقل البروتينات أو الأحماض النووية بسهولة من المواد الهلامية الصغيرة إلى الأغشية. تتلاءم بدقة مع XCell SureLock و XCell II Mini-Cells بدلاً من مجموعة قلب الهلام / المخزن المؤقت. يتطلب أقل من 200 مل من المخزن المؤقت للنقل لعمليات النقل الغربية والجنوبية والشمالية. تخلق الأقطاب الكهربائية القوية المصنوعة من التيتانيوم والفولاذ المقاوم للصدأ مجالًا كهربائيًا موحدًا بدون مشابك أو حاملات هلام مفصلية. أقصى حجم لطخة هو 9 سم × 9 سم. تعلم المزيد هنا.


الكهربائي (مع رسم بياني)

يصف مصطلح الرحلان الكهربائي هجرة الجسيمات المشحونة تحت تأثير المجال الكهربائي. تمتلك العديد من الجزيئات الحيوية المهمة - مثل الببتيد ونيوكليوتيدات البروتينات والأحماض النووية - مجموعات متأينة ، وبالتالي ، في أي درجة حموضة معينة ، توجد في محلول كأنواع مشحونة كهربائيًا إما كاتيونات (+) أو أنيونات (-).

تحت تأثير المجال الكهربائي ، ستهاجر هذه الجسيمات المشحونة إما إلى الكاثود أو إلى القطب الموجب ، اعتمادًا على طبيعة شحنتها الصافية.

تتكون المعدات المطلوبة للرحلان الكهربي بشكل أساسي من عنصرين - حزمة طاقة ووحدة رحلان كهربي. وحدات الرحلان الكهربائي متاحة لتشغيل نظام الهلام الرأسي أو الأفقي. يظهر جهاز الكهربي الهلامي الأفقي والعمودي النموذجي بشكل منفصل في التين. 2.1 و 2.2.

توفر حزمة الطاقة تيارًا مباشرًا بين الأقطاب الكهربائية في وحدة الكهرباء والرحلان. يتم إجراء كل الرحلان الكهربي في مخزن مؤقت مناسب ، وهو أمر ضروري للحفاظ على حالة تأين ثابتة للجزيئات التي يتم فصلها وخجولها. أي اختلاف في الرقم الهيدروجيني من شأنه أن يغير الشحنة الإجمالية ، وبالتالي ، يتم فصل الحركات الحركية للجزيئات.

أدى إدخال استخدام المواد الهلامية كوسيط دعم إلى تحسن سريع وخجل في طرق تحليل الجزيئات الكبيرة. كان أول نظام جل تم استخدامه هو هلام النشا ، وعلى الرغم من أن هذا لا يزال له بعض الاستخدام ، إلا أن الغالبية العظمى من التقنيات الكهربية والشفائية المستخدمة في الوقت الحاضر تتضمن إما هلام agarose أو هلام بولي أكريلاميد.

مرة أخرى ، هناك أنواع مختلفة من بولي أكريلاميد جل الكهربائي (PAGE) والتي يتم تطبيقها لفصل البروتينات والأحماض النووية. من بين هذه التقنيات تم استخدام الرحلان الكهربائي جل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد (SDS- PAGE) على نطاق واسع. يظهر في الشكل 2.3 فصل نموذجي لبروتينات هلام بولي أكريلاميد SDS. غالبًا ما تستخدم هذه التقنية لتنقية جزيء البروتين.


شاهد الفيديو: تبسيط العلوم:التفريد الكهربى للبروتينات SDS PAGE (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Moran

    هل لديك الصداع النصفي اليوم؟

  2. Telen

    لافت للنظر

  3. Carlos

    أنا آسف ، لكن أعتقد أنك مخطئ. دعونا نناقش هذا. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا على PM.

  4. Frika

    يمكننا فحص هذا بلا حدود

  5. Edingu

    أررا! اكتشافات جديدة للجماهير. دع خلافة لا تتوقف إلى الأبد وإلى الأبد.



اكتب رسالة