معلومة

كيف تؤثر مصفوفات زراعة الأنسجة المختلفة على الخلفية في الفحص المجهري الفلوري؟

كيف تؤثر مصفوفات زراعة الأنسجة المختلفة على الخلفية في الفحص المجهري الفلوري؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

رداً على سؤالي السابق ، كنت أقرأ قليلاً عن بولي-د-ليسين ، كولاجين 1 ، كولاجين 4 ، لامينين ، وطلاءات زراعة الأنسجة الأخرى التي تعزز التصاق الخلايا. لقد افترضت دائمًا أن أي شيء بخلاف البلاستيك أو الزجاج القياسي المعالج بـ TC سيزيد من الخلفية بشكل كبير ، ولكن ربما تكون آرائي حول الفلورة الخلفية قديمة بعض الشيء. هل لدى أي شخص خبرة مع هذه في بيئة الفحص المجهري الفلوري / عالي الإنتاجية؟

في حالتي على وجه التحديد ، أبحث في الالتقام الخلوي وتهريب البروتين المسمى إلى الجسيم الحال. أقوم بتسمية البروتين بصبغة pHrodo المعتمدة على الرقم الهيدروجينيTM من المجسات الجزيئية ، التي يُفترض أنها تحتوي على القليل جدًا من التألق عند درجة الحموضة المحايدة ، ولكنها تصبح ساطعة للغاية حيث ينخفض ​​الرقم الهيدروجيني عندما تصبح الحويصلات الداخلية ليستزومات. هذا يعني نظريًا أن خطوة الغسيل النهائية ليست ضرورية ، ولكن مع طلاء المصفوفة على الألواح أشعر بالقلق بشأن الخلفية.

إذن ، ما هو التفكير الحالي فيما يتعلق بتألق الخلفية لمصفوفات TC المختلفة؟ هل تأتي الخلفية من المصفوفة نفسها ، أم من خلال امتصاص الصبغة الفلورية لها؟ هل تعتمد على الطول الموجي؟ لحسن الحظ ، قد لا أكون عالقًا مع خلاياي ضعيفة الالتصاق ، وقد لا أحتاج إلى مصفوفة تكميلية على الإطلاق في النهاية ، لكنني ما زلت أريد فهمًا أفضل لكيفية عملها.


تتألق المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وخاصة الكولاجين واللامينين. الحد الأقصى موجود في قنوات DAPI و FITC ويصبح التألق أضعف تجاه الأطوال الموجية الأطول. ومع ذلك ، نظرًا لأن الغلاف الموجود على قوارير TC رقيق جدًا ، لا أتوقع أن تكون هذه مشكلة. أفضل شيء هو مجرد تجربته. هناك أيضًا مستند مشهور متوفر قد يكون مفيدًا:

تألق ذاتي: الأسباب والعلاج


التصوير متعدد الأطياف في علم الأحياء والطب: شرائح من الحياة †

يمر التصوير متعدد الأطياف (MSI) حاليًا بفترة انتقال من دوره كتقنية غريبة إلى أن يتم تقديمه بشكل أو بآخر من قبل جميع مصنعي المجهر الرئيسيين. هذا لأنه يوفر حلولًا لبعض التحديات الرئيسية في التصوير القائم على التألق ، أي تخفيف عواقب وجود التألق الذاتي والحاجة إلى استيعاب مستويات عالية نسبيًا من تعدد إرسال الإشارات بسهولة. MSI ، التي تميز التألق الذاتي طيفيًا وتزيلها حسابيًا ، تعزز الإشارة إلى الخلفية بشكل كبير ، وتكشف عن أهداف محجوبة بخلاف ذلك. بينما تركز هذه المقالة على الأمثلة المستمدة من التكنولوجيا القائمة على المرشح القابل للضبط البلوري السائل ، فإن القصد هو عرض مزايا التصوير متعدد الأطياف بشكل عام. تتوافق بعض التقنيات المستخدمة لإنشاء صور متعددة الأطياف مع تكوينات بصرية معينة فقط ، مثل الفحص المجهري بالليزر المتحد البؤر لمسح النقاط. يمكن أن تقترن الأساليب المتسلسلة الشريطية ، مثل تلك التي توفرها المرشحات الانضغاطية البلورية السائلة (LCTFs) ، بمجموعة متنوعة من طرق التصوير ، والتي ، بالإضافة إلى الفحص المجهري الفلوري ، تشمل الفحص المجهري للحقل الساطع (غير الفلوري) وكذلك الحيوانات الصغيرة ، التصوير غير الباضع في الجسم الحي. الفحص المجهري في برايتفيلد هو الشكل المختار لعلم التشريح المرضي ، والذي يعتمد على الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتوفير المعلومات السريرية التي تم حلها جزيئيًا. ومع ذلك ، على عكس الملصقات الفلورية ، فإن العديد من الكروموجينات ، إذا كانت متداخلة مكانيًا ، يكون من الصعب جدًا فصلها وتقديرها ، ما لم يتم استخدام أساليب MSI. التصوير في الجسم الحي هو مجال سريع النمو مع تطبيقات في علم الأحياء الأساسي ، واكتشاف الأدوية ، والطب السريري. يمكن أن تكون حساسية التصوير في الجسم الحي القائم على التألق ، كما هو الحال مع الفحص المجهري الفلوري ، محدودة بسبب وجود تألق ذاتي كبير ، وهو قيد يمكن التغلب عليه من خلال استخدام MSI. © 2006 الجمعية الدولية لعلم الخلايا التحليلي

التصوير متعدد الأطياف هو الحصول على معلومات تم حلها طيفيًا في كل بكسل من مشهد مصور. يمكن استخدام العديد من التقنيات المختلفة لتوليد مثل هذه المعلومات ، بدءًا من عجلات المرشح متعددة المواضع ، وحواجز شبكية ومنشورات ، وأجهزة قياس الطيف أحادية النقطة للمسح بالليزر ، والمرشحات القابلة للضبط إلكترونيًا ، ومطياف التصوير بتحويل فورييه ، والتحليل الطيفي للتصوير المقطعي (تمت مراجعته في المرجع (1)). سيسلط هذا التقرير الضوء على استخدام مناهج التصوير متعدد الأطياف القائمة على مرشح الكريستال السائل (LCTF) ، جنبًا إلى جنب مع أدوات التحليل الخاصة بالتطبيق ، لمجموعة متنوعة من مهام التصوير ، ولكن يجب أيضًا قراءته كعرض تقديمي لمزايا MSI في جنرال لواء.


مراجعة المادة

  • قسم الجراحة التجميلية وجراحة اليد ، مستشفى جامعة إرلانجن ، فريدريش & # x2013 جامعة ألكسندر ، Erlangen & # x2013N & # x00FCrnberg (FAU) ، Erlangen ، ألمانيا

يوفر نهج دراسة الفحص المجهري داخل الحجاج (IVM) العديد من المزايا في المختبر, خارج الجسم الحي، ونماذج ثلاثية الأبعاد. يوفر IVM تصويرًا في الوقت الفعلي للأحداث الخلوية ، مما يوفر لنا صورة شاملة للعمليات الديناميكية. سمح التحسن السريع في تقنيات الفحص المجهري بتصوير الأنسجة العميقة بدقة أعلى. تتيح التطورات في طرق وضع العلامات الفلورية إمكانية تتبع أنواع خلايا معينة. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون IVM بمثابة أداة مهمة لدراسة مراحل مختلفة من عمليات تجديد الأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن تحليل توافق التركيبات المختلفة للأنسجة. يعد IVM أيضًا نهجًا واعدًا للتحقيق في ردود فعل المضيف على المواد الحيوية المزروعة. يمكن أن يوفر IVM ملاحظات فورية لتحسين استراتيجيات هندسة الأنسجة. في هذه المراجعة ، نهدف إلى تقديم لمحة عامة عن متطلبات وتطبيقات مناهج الإدارة المتكاملة للنظم المختلفة. أولاً ، سنناقش تاريخ تطوير IVM ، ثم سنقدم نظرة عامة على الأساليب البصرية المتاحة بما في ذلك الإيجابيات والسلبيات. لاحقًا ، سوف نلخص طرق وضع العلامات الفلورية المختلفة. في القسم الأخير ، سنناقش النماذج الراسخة المزمن والحادة IVM للأعضاء المختلفة.


الصورة 2

تختلف شدة التألق المطلق بشكل كبير بين أنسجة الرئة العادية (ن = 36) ، والأنسجة المحيطة (ن = 30) ، والسرطانية (ن = 52). يتم تقديم الأهمية بواسطة "*" (p & lt 0.05) و "**" (p & lt 0.01) و "***" (p & lt 0.001).


إزالة الأنسجة والحفاظ على GFP في القلب

يرتبط التطور السريع واستخدام تقنيات إزالة الأنسجة بالتطور السريع لأساليب التصوير ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر والفحص المجهري للورقة الضوئية. يمكن استخدام هذه الطرق معًا لإعادة بناء تشريح الأنسجة ثلاثي الأبعاد (Costantini et & # x000a0al. ، 2019).

أحد الكائنات الحية النموذجية الرئيسية في البحث البيولوجي هو نموذج الفأر ، بمجموعة واسعة من التعديلات الجينية المحتملة بما في ذلك إدخال البروتينات ذات العلامات الفلورية (على سبيل المثال ، GFP) كجينات مراسلة. استخدمت أول طرق تطهير الأنسجة المطورة مركبات كارهة للماء ، والتي تعمل على تجفيف الأنسجة والجفاف وإخماد البروتينات الفلورية المُدخلة (أي GFP). لتجنب هذه الظاهرة ، تم تطوير العديد من حلول المقاصة المائية (القائمة على الماء). ومع ذلك ، فإن الطرق القائمة على الماء كان لها أداء أقل في تطهير الأنسجة (Silvestri et & # x000a0al. ، 2016) ، مع الحفاظ على التألق. يوضح الشكلان 2 C و 2 D الحفاظ على مضان GFP في القلب الجنيني للمراحل المختلفة (ED10.5 و ED14.5) بواسطة طريقة تطهير الأنسجة CUBIC. إلى جانب استخدام محلول المقاصة المحبة للماء ، هناك طريقة أخرى للحفاظ على التألق وهي طريقة تحويل الأنسجة التي تتضمن تضمين الأنسجة في هلام الأكريلاميد & # x02014 CLARITY (Chung et & # x000a0al. ، 2013).

أمثلة على مناعة والحفاظ على مضان GFP مع تطهير الأنسجة على قلب الفأر النامي

(A و B) الكيمياء المناعية المدمجة مع BABB على جنين الماوس ED 9.5 ، والأجسام المضادة للأكتين العضلية الملساء (SMA) في وضع العلامات الحمراء على عضلة القلب ، CD31 (PECAM-1) باللون الأخضر لتلطيخ الشغاف (B) ، وتلطيخ DAPI النووي (ليس كثيرًا مميزة عند هذا التكبير المنخفض) باللون الأزرق.

(C و D) الحفاظ على مضان GFP الطبيعي مع تطهير الأنسجة CUBIC على ED 10.5 (C) و ED 14.5 (D) في قلوب جنين الفأر Connexin 40 - GFP (Cx40-GFP) مع تألق ذاتي متراكب باللون الأحمر. تكون الترابيق البطيني والأذينين موجبين لـ Cx40 في هذه المراحل. يوجد دم ذاتي الفلورسنت في البطينين (C). تم التقاط جميع الصور بالمجهر (كنفوكل). يمثل شريط المقياس 100 & # x000a0 & # x003bcm في جميع الأشكال.

أجرى Xu وزملاؤه (Xu et & # x000a0al.، 2019b) تحليلًا مفصلاً للحفاظ على الفلورة بواسطة طرق المقاصة المختلفة على أنسجة الأمعاء. وأكدوا أن معظم طرق المقاصة المائية كان أداؤها أفضل في الحفاظ على الفلورة من تلك المعتمدة على المذيبات العضوية. عند قياس نسبة الإشارة إلى الخلفية بعد إزالة الأنسجة ، وجدوا أن أفضل طريقة للحفاظ على التألق هي الفاكهة ، تليها ScaleS و SeeDB. ومع ذلك ، حافظت CUBIC و PACT على مستويات مماثلة من التألق مثل 3DISCO و uDISCO ، وهما من عوامل المقاصة العضوية الكارهة للماء. لم يشملوا CLARITY واختلافاته في اختبارهم. على الرغم من أن دراستهم تضمنت أنسجة القلب ، إلا أن الجزء المتعلق بالحفاظ على الفلورة تم إجراؤه على الأمعاء ، والتي قد تتفاعل بشكل مختلف عن أنسجة القلب الكثيفة وذات الأوعية الدموية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لـ 3DISCO و uDISCO و FRUIT على أنسجة القلب. تم تلخيص نظرة عامة في الشكل & # x000a01.

فقط عدد قليل من الدراسات قامت بتحليل مباشر لتوافق تطهير الأنسجة والحفاظ على التألق في أنسجة القلب البالغة أو الجنينية. في دراستنا السابقة (Kolesova et & # x000a0al. ، 2016) استخدمنا أساليب المقاصة CLARITY و SCALE و CUBIC و DBE وقارننا قدرتها على الحفاظ على مضان GFP في القلوب الجنينية (موضحة في الأشكال 2 C و 2 D و & # x200B و 3 B 3 B مع تطهير الأنسجة CUBIC على Cx40: GFP trabeculae والأوعية الدموية التاجية في قلوب الجنين). وجدنا أن CUBIC نظف الأنسجة إلى مستوى أعمق مقارنة بالمقياس وبالتالي كان أكثر ملاءمة لتحليل القلوب السليمة. ومع ذلك ، على الرغم من أن SCALE حافظ أيضًا على إشارة GFP ، إلا أنه قام فقط بمسح الطبقات السطحية للقلب ، والتي قد تكون كافية لدراسات الأوعية الكبيرة للأوعية الدموية التاجية (Kolesova et & # x000a0al. ، 2016). كان الفرق بين SCALE و CUBIC أكثر وضوحًا في قلوب ما بعد الولادة ، حيث قام CUBIC بتطهير القلوب بشكل فعال ، في حين أن المقياس لم يكن كذلك (Shaikh Qureshi et & # x000a0al.، 2016). اختبرت دراسة أخرى قدرة CUBIC على الحفاظ على إشارات الفلورسنت المختلفة في أنسجة القلب (Nehrhoff et & # x000a0al. ، 2016). وجدوا أن المقاصة CUBIC يمكنها أيضًا الحفاظ على البروتينات الفلورية الأخرى مثل TdTomato و GFP في أقسام قلب بسمك 750 & # x003bcm.

تصور الأوعية الدموية التاجية في القلوب النامية

(أ) تم حقن الأوعية الدموية مع DiI في جنين السمان ED9.

(ب) تم تصور الشرايين التاجية على سطح قلب لجنين فأر ED18.5 Cx40-GFP تم تطهيره باستخدام CUBIC. تم تصويره على مجهر متحد البؤر.

(C) تحليل القلب المحقون DiI مع الأوعية التاجية pseudocolored للإشارة إلى العمق داخل جدار البطين ، جنين السمان ED13.

(د) قلب فأر الأحداث مع الأوعية التاجية المحقونة بالميكروفيل والشرايين التاجية الرئيسية المشار إليها باللون: الشريان التاجي الأيمن (البرتقالي) وفرعه ، الشريان الحاجز (الأحمر) ، والشريان التاجي الأيسر (الأصفر). تم تصويره على ماسح التصوير المقطعي المحوسب الصغير.

ثبت أيضًا أن CLARITY تحافظ على العديد من البروتينات الفلورية مثل GFP و mCherry و mOrange و Cerulean في أنسجة القلب (Sereti et & # x000a0al. ، 2018). أيضًا ، تم استخدام بروتوكولات CLARITY المعدلة لتحليل أنسجة القلب. تم استخدام SUT (تحديث مخطط لشفافية الأنسجة ، مزيج من CUBIC و CLARITY) لتحليل التئام التليف في احتشاء عضلة القلب (Wang et & # x000a0al. ، 2018). تم استخدام SCM (طريقة CLARITY المبسطة) لتحليل أنسجة القلب (Sung et & # x000a0al. ، 2016) ومع ذلك ، تم الحصول على نتائج أفضل عندما تم غسل الدم من القلب قبل التثبيت حيث أدى إزالة لون الهيم باستخدام العلاج بالكحول الأميني إلى تقليل مضان YFP في عينات القلب (Sung et & # x000a0al. ، 2016).


أساليب

خطوط الخلية

تم الحفاظ على خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية MCF7 (HTB-22 ، ATCC) و MDA-MB-231 (HTB-26 ، ATCC) في وسط أساسي أساسي بحد أدنى α (α-MEM SH30265 ، GE Healthcare) ، مكمل بـ 10 ٪ بقري جنيني مصل (FBS S11150 ، Atlanta Biologicals) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S 15140 ، GIBCO). تم الحفاظ على خط خلايا سرطان البروستاتا البشرية PC3 في وسط RPMI-1640 (23400-021 ، GIBCO) مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. تم الحفاظ على خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) وخلايا HN5 في وسط Dulbecco المعدل النسر (DMEM SH30022FS ، GE Healthcare) ، مكمل بـ 10 ٪ FBS ، 1 ٪ P / S ، 1 ملي بيروفات الصوديوم (11360070 ، GIBCO) ، 2 مم L- الجلوتامين (25030081 ، GIBCO) ، 1٪ فيتامين MEM (11120052 ، GIBCO) ، و 1٪ MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA 11140050 ، GIBCO). تم الحفاظ على خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HCT116 وخلاياها المشتقة - خلايا DNA-PKcs المفكوكة (KO) 41 - في α-MEM مع 10 ٪ FBS و 1 ٪ P / S. تمت زراعة جميع الخلايا في نسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.

تصنيع جهاز PDMS-HDA

اعتمد تصنيع جهاز PDMS-HDA على ركيزة مسطحة (أي 22 * ​​22 مم 2 غطاء زجاجي) مثبتة بشريط لاصق (3 M سكوتش 810) ، والذي يستخدم كقالب لمنع تسرب المحلول الشكل 1. (أ). تم بعد ذلك صب خليط Polydimethylsiloxane (PDMS Sylgard 184 ، Dow Corning) في القالب وسبك عند 125 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. كانت نسبة وزن القاعدة إلى عامل المعالجة 10: 1 ، وكان وزن البوليمر الأولي PDMS 0.5 جم لكل شريحة. تم تعقيم الرقاقة بواسطة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة بعد إزالة الشريط وتخزينها في طبق معقم عن طريق الغلق باستخدام البارافيلم في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.

ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد بواسطة PDMS-HDA

قبل تحميل الخلايا ، كان محلول كولاجين من النوع الأول سعة 1 مل (

تم تحضير 4.26 مجم / مل C3867 ، SIGMA) عن طريق إضافة وسط زراعة الخلية و 1 نيتروجين هيدروكسيد الصوديوم لتعديل الأس الهيدروجيني (تم الإبلاغ عن التفاصيل في الجدول التكميلي S1). قبل كل تجربة فردية ، تم قياس الأس الهيدروجيني لمحلول الكولاجين ليكون حول الرقم الهيدروجيني 7.4. ثم تم إعادة تعليق الخلايا في محاليل بتركيزات مختلفة من الكولاجين (0 ، 50 ، 500 ، 1000 ميكروغرام / مل). في الثقافة الكروية ثلاثية الأبعاد الشكل 1 (ج) ، تم توزيع القطرات الخلوية بحجم 1 ميكرولتر على جهاز PDMS-HDA (الخطوة 1) بواسطة آلة تسليم السائل (Versa 10 spotter ، Aurora Instruments Ltd.) الشكل 1. (ب). يبلغ متوسط ​​قطر كل قطرة 1.4 ملم. تم قلب الجهاز ووضعه في طبق استزراع خلوي بحجم 6 سم ، والذي كان مملوءًا مسبقًا بوسط 750 ميكرولتر ومختومًا بمادة بارافيلم لمنع تبخر القطرات المحتوية على الخلية. تم نقل المجموعة بأكملها على الفور إلى حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح بتكوين ألياف الكولاجين ، مما ساهم في ترسيب الخلايا وتجميعها (الخطوتان 2 و 3) ، مما يعزز توليد الأجسام الشبه الكروية الخلوية (الخطوة 4) .

تقييم حجم الخلية الكروية

تم حساب متوسط ​​حجم الأجسام الشبه الكروية الخلوية ثلاثية الأبعاد بناءً على قياسات أقطارها بواسطة برنامج تصوير مفتوح المصدر (فيجي). على الرغم من أن بعض الأجسام الشبه الكروية كانت بيضاوية أو ذات شكل غير منتظم ، فإن متوسط ​​القطر (ل) من خلال المعادلة التالية: ل = (أ × ب) 1/2 أين أ و ب تمثل القطرين المتعامدين لكل كروي. الحجم المتوسط ​​(الخامس) من الأجسام الشبه الكروية من خلال المعادلة (V = 4 times pi times <(l / 2)> ^ <3> / 3 ).

وسم الخلية والتصوير

كانت الثقافات الموجودة على جهاز PDMS-HDA ملطخة بمزيج من 2 ميكرومتر كالسين AM و 4 ميكرومتر من الإيثيديوم homodimer-1 (مجموعة الجدوى الحية / الميتة ، L3224 ، Thermo Fisher Scientific Inc.) لتلوين الخلايا الحية والميتة ، على التوالي. تم تحضين الجهاز تحت 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم التقاط صور المجال الساطع والفلوريسنت باستخدام كاميرا CCD (SPOT Flex ، SPOT Imaging) على مجهر قائم. تم إجراء تحليل الصورة بواسطة برنامج التصوير فيجي.

فحص فحص المخدرات

لإثبات أن جهاز PDMS-HAD يمكنه فحص الأدوية المضادة للسرطان ، تم اختبار الأجسام الشبه الكروية المختلفة (من خلايا MCF7 و MDA-MB-231 و PC3 و OSC19 و HN5) بعد العلاج بأدوية العلاج الكيميائي باكليتاكسيل (T7402 ، SIGMA ) وسيسبلاتين (P4394 ، سيغما) بتركيزات من 0 إلى 50 ميكروغرام / مل. بناءً على الإجراء الموصوف سابقًا ، تم الحصول على الأجسام الشبه الكروية أحادية الخلية بكثافة خلية أولية تبلغ 450 / ميكرولتر داخل كل 500 ميكروغرام / مل من القطرات المتوسطة المحتوية على الكولاجين لثقافة لمدة يومين. باتباع الإجراء الموضح في الشكل 2 (أ) ، تم الاستغناء عن قطرة تحتوي على 1 ميكرولتر مع ضعف تركيز الاختبار النهائي (0 أو 5 أو 25 أو 50 ميكروغرام / مل) إلى القطرات المناسبة المحتوية على خلية ، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 2 ميكرولتر لكل قطرة. بعد علاج دوائي لمدة يومين ، تم تحقيق بقاء الخلية باستخدام مقايسة CellTiter-Blue (عند إثارة 520 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر G8080 ، Promega Corp.) بحجم 1 ميكرولتر لكل خلية قطرة تم تحضينها لمدة 4.5 ساعة. تم استخدام مجهر فلوري (BX51 ، OLYMPUS) لالتقاط الصور الفلورية للقطرات المحتوية على عقار الخلية. تم استخدام الصور الفلورية لتفسير كمية الخلايا الحية. ثم تم تحليل شدة الفلورسنت لكل قطرة بواسطة برنامج التصوير فيجي. تم تطبيع قابلية الخلية النسبية ، المقابلة لشدة الفلورسنت ، ضد الخلايا غير المعالجة تحت تركيزات دوائية مختلفة.

ل على الجهاز فحص الدواء ثنائي الأبعاد ، 1 ميكرولتر من المعلقات الخلوية الممزوجة مع 2 ميكروغرام / مل من الكولاجين ، المستخدم لتسهيل التصاق الخلايا على PDMS ، تم الاستغناء عنها أولاً على الجهاز واستزراعها لمدة يومين دون التقليب. تم إجراء تجارب حساسية الدواء التالية في نفس الظروف مثل فحص الدواء ثلاثي الأبعاد المذكور سابقًا. بالنسبة لتجارب التحكم ثنائية الأبعاد من 96 طبقًا جيدًا ، تم طلاء الخلايا بكثافة 6000 خلية في وسط 100 ميكرولتر لكل بئر لمدة يومين. تم تبادل وسائل الإعلام وفقًا لذلك مع الوسائط المحتوية على المخدرات للحصول على ثقافة إضافية لمدة يومين. تمت إضافة عشرة ميكرولتر من CellTiter-Blue إلى كل بئر وحضنت الصفائح لمدة 4.5 ساعة. تم استخدام قارئ لوحة (POLARstar Optima ، BMG LABTECH) لتحديد شدة الفلورسنت ، وتم تقييم الصلاحية الخلوية باتباع الإجراء الموصوف سابقًا.

مقايسة انتشار الورم

تم إجراء مقايسة انتشار الورم باتباع الإجراء الموضح في الشكل 3 (أ). تم إنتاج الأجسام الشبه الكروية الورمية المستزرعة لمدة يومين من بذر الخلية الأولي لـ 900 خلية. تم الاستغناء عن القطرات المحتوية على كروي مع 10 ميكرولتر من القطرات المتوسطة مع أو بدون الأدوية. كان الارتفاع الناتج لكل قطرة (الحجم الإجمالي 11 ميكرولتر) حوالي 1.2 ملم. من أجل العلاج المشترك ، تم إضافة الأدوية إلى الجهاز قبل تشعيع-ray. تم قلب الجهاز ووضعه على طبق زرع خلية بحجم 6 سم. يبلغ ارتفاع الجدار المدعوم للجهاز 1.5 مم ويمنع بشكل كافٍ الاتصال غير المرغوب فيه بين مجموعة الإسقاط والركيزة التي تم فحصها. تم تحويل المصفوفة الكروية إلى الركيزة في غضون ثوانٍ ، متبوعة بمجهود مع ضغط موحد على الجهاز ، وفصلها في نفس الوقت عن الركيزة ، انظر المثال في الشكل 3 (ب). كان حجم كل قطرة مقلوبة حوالي 5 ميكرولتر. كان الطبق مملوءًا بالوسيط ومختومًا بالبارافيلم لمنع التبخر. تم نقل الطبق إلى 5٪ CO2 حاضنة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح للخلية الشبه الكروية التمسك الركيزة. متوسط ​​مع أو بدون الأدوية يضاف إلى الطبق بعد يوم واحد. لوحظ الانتشار الخلوي يوميًا تحت المجهر ، وتم اشتقاق منطقة الهجرة عن طريق قياس الهجرة الخلوية التي تم طرحها من المنطقة الأولية في اليوم 0.

مقايسة الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد

تم تكييف جهاز PDMS-HDA مع الإجراء الموضح في الشكل 4 أ لدراسة ما إذا كان يمكن لمزارعين من الخلايا الفردية في 3D التأثير على بعضهما البعض. الجهاز هو أداة ناشئة لنمذجة تفاعلات الخلايا الخلوية على مستويات الأنسجة المختلفة 32. تم إنشاء اثنين من الخلايا الشبه الكروية (مثل نوع الخلية A والنوع B) عند فجوة 1.5 مم. بعد الزراعة لمدة يومين ، تم الاستغناء عن 1 ميكرولتر من Matrigel على القطرات المحتوية على الخلية يدويًا عند 4 درجات مئوية. تمت إضافة عشرة ميكرولتر من الوسط إلى القطرتين المتجاورتين بعد تكوّن هلام Matrigel عند 37 درجة مئوية طوال الليل. لوحظ متوسط ​​الأقطار لاثنين من الأجسام الشبه الكروية المنفصلة يوميًا. تم تقييم الحجم الكروي بالمعادلة المذكورة سابقًا ، (V = 4 times pi times <(l / 2)> ^ <3> / 3 ).

مقايسة الغزو ثلاثي الأبعاد

لإجراء فحص الغزو الكروي للورم باستخدام جهاز PDMS-HDA ، تم إنشاء الأجسام الشبه الكروية الخلوية أولاً على الجهاز لمدة 24 ساعة ، باتباع الإجراء الموضح في الشكل 5 (أ). تمت إضافة مصفوفات سقالة ثلاثية الأبعاد من 10 ميكرولتر إلى كل قطرة تحتوي على كروي الخلية ، والتي تم خلطها مع Matrigel و Collagen-I (في PBS عند درجة الحموضة 7.4) بنسبة 1: 1. كان التركيز النهائي لماتريجيل 5 مجم / مل وكان تركيز الكولاجين الأول 1.5 مجم / مل. سهلت إضافة الكولاجين- I إلى Matrigel الغزو عن طريق زيادة صلابة المصفوفة 42. لاحظنا أن الخلايا الموجودة في الجل المختلط غزت بشكل أكثر فعالية من مادة Matrigel أو هلام الكولاجين المستخدم بمفرده (البيانات غير معروضة). تم الاستغناء عن خمسة ميكرولتر من عامل نمو البشرة (EGF 236-EG-200 ، أنظمة R & ampD) - مصفوفات سقالة مغلفة بجانب القطرة الكروية المقابلة عند فجوة 1.5 مم. تم استخدام EGF بتركيزات 0 و 10 و 50 نانوغرام / مل. بعد تكوين الهلام لمصفوفة السقالة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، تم الاستغناء عن 20 ميكرولتر من وسائط الاستزراع القياسية أو الوسائط المحتوية على NU7441 وربطها بقطرتين جل متجاورتين في اليوم 0. تسمح إضافة الوسيط بتوليد في المختبرمثل البيئة المكروية ، حيث يمكن إنشاء تدرج لـ EGF من المصفوفة المغلفة لتحفيز وتنسيق غزو كروي قريب الشكل 5 (أ). من أجل العلاج المركب ، تمت إضافة الأدوية إلى الجهاز قبل تشعيع-ray. لوحظ غزو كروي يوميًا عن طريق الفحص المجهري. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم منطقة الغزو كمقياس للانتشار الخلوي مطروحًا من المنطقة الأولية في اليوم 0.

تحليل احصائي

تم استخدام اختبار t للطالب لمقارنة البيانات من مجموعتين. تم استخدام اختبار TukeyHSD ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة البيانات من أكثر من مجموعتين. اعتبر p & lt 0.05 أن يكون ذا دلالة إحصائية.


الكاتب الاشتراكات

TN و MS بحثًا مصممًا من قبل TN و ME و CR و JS و JMU و PF و SW و LO و AM أجرى بحثًا PL و MDF و BMM و AC و AJM ساهم في الكواشف الجديدة / خطوط المصنع / الأدوات التحليلية TN ، ME ، CR ، JS ، قامت PF و SW و SJM-S بتحليل البيانات وكتبت TN و MS الورقة بمساعدة جميع المؤلفين المشاركين.

يرجى ملاحظة ما يلي: Wiley Blackwell ليست مسؤولة عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المواد المفقودة) إلى علم النبات الجديد المكتب المركزي.

الشكل S1 تنقية بروتين roGFP2-Orp1 غير المتجانسة وأطياف الانبعاث و H.2ا2معدلات الأكسدة المعتمدة.

الشكل S2 تحليل حالة الأكسدة والاختزال roGFP2-Orp1 الخلوي في أنسجة شتلة نبات الأرابيدوبسيس المختلفة.

الشكل S3 استجابات الأكسدة والاختزال لخطوط roGFP2-Orp1 Arabidopsis المستقلة و في بلانتا أطياف مستشعر الميتوكوندريا المختزل.

الشكل S4 التعبير عن مسبار الفلورسنت cyt-roGFP2-Orp1 في Arabidopsis.

الشكل S5 استجابة الأكسدة والاختزال لـ 2 ′ و 7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate و mt-roGFP2-Orp1 في شتلات الأرابيدوبسيس إلى ميناديون.

الشكل S6 استجابة cyt-roGFP2-Orp1 للانفجار المؤكسد الذي يسببه flg22 في أقراص أوراق نبات الأرابيدوبسيس المعالجة بالديفينلين اليودونيوم.

طرق S1 استنساخ أجهزة الاستشعار وإنشاء خطوط المصنع.

طرق S2 ثقافة النبات.

طرق S3 تنقية بروتين roGFP2-Orp1.

طرق S4 المنتفعون.

الجدول S1 تسلسل التمهيدي لاستنساخ نواقل التعبير.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


نماذج مراسل الماوس الفلورية لتصوير الأنسجة

تم استخدام عدة أنواع من نماذج مراسل الفلورسنت ، اعتمادًا على التطبيق على حد سواء التأسيسي والمحفز ، بشكل فردي أو مجتمعة لتصوير نسيج الأديم الظاهر الحي (ملخصة في الجدول 1). يمكن تقسيم هذه النماذج إلى ثلاث فئات متداخلة جزئيًا: مؤشرات السلوك الخلوي ، هوية الخلية / مصيرها ، نشاط الإشارة. تتضمن أمثلة المراسلين عن السلوكيات الخلوية المراسلين لتصوير أقسام الخلية مثل نموذج R26-H2B-EGFP (هادجانتوناكيس وبابايوانو ، 2004) ومراسلو دورة الخلية الفلورية (Fucci) القائمة على مذبذب ubiquitinoylation التي تسمح بالمتابعة المباشرة في الوقت الفعلي لـ تقدم دورة الخلية في الخلايا الفردية بإشارة فلورية نووية متغيرة الألوان ديناميكيًا (Sakaue-Sawano et al. ، 2008 Mort et al. ، 2014). تم استخدام هؤلاء المراسلين أيضًا لمتابعة حركات الخلية بالتصوير الحي. يسمح غشاء الخلية المحرض الفلوريسنت للصحفيين مثل R26R mT / mG (Muzumdar et al. ، 2007) و R26R Confetti (Snippert et al. ، 2010) بتصور نوع الأنسجة ، وتغيرات شكل الخلية ، وتتبع النسب ، وتتبع أساليب وضع العلامات النادرة. من الخلايا الفردية. مراسل الإشارات TCF / Lef: H2B-GFP (Ferrer-Vaquer et al. ، 2010) هو مراسل فلوري حساس لتنشيط إشارات Wnt الكنسي ويستند إلى مواقع ربط عامل النسخ الترادفي التي تقود التعبير عن بروتين الاندماج H2B-EGFP. من أمثلة مراسلي الفلورسنت لتحديد هوية الخلية مراسل Shh GFP & # x2013Cre (Harfe et al. ، 2004) الذي يصور هوية مركز الإشارة ، Sox2-GFP لخلايا تكثيف بصيلات الشعر (Biggs et al. ، 2018) والكيراتين 17-GFP إلى تصور ظهارة عضو الأديم الظاهر (Bianchi et al. ، 2005 Ahtiainen et al. ، 2014).

الجدول 1. نماذج مراسل الماوس الفلورية لتصوير الأنسجة الحية لتكوين الأديم الظاهر.


مراجع

Ombrato، L. et al. يكشف وضع العلامات النقيلية المتخصصة عن الخلايا المتنيّة ذات السمات الجذعية. طبيعة سجية 572, 603–608 (2019).

ديل بوزو مارتن ، واي وآخرون. يعزز الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية اللحمية المتوسطة التنشيط المناسب ، والارتداد الظهاري ، والاستعمار النقيلي. مندوب الخلية. 13, 2456–2469 (2015).

Quail، D.F & amp Joyce، J. A. تنظيم البيئة المكروية لتطور الورم والورم الخبيث. نات. ميد. 19, 1423–1437 (2013).

Klemm، F. & amp Joyce، J. A. التنظيم المكروي للاستجابة العلاجية للسرطان. اتجاهات خلية بيول 25, 198–213 (2015).

Barash، S.، Wang، W. & amp Shi، Y. وصف ببتيد إشارة إفرازية بشرية بواسطة نموذج ماركوف المخفي وتوليد ببتيد إشارة اصطناعي قوي للتعبير عن البروتين المفرز. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 294, 835–842 (2002).

فلينترمان ، إم وآخرون. توصيل البروتينات العلاجية كمنتجات اندماج TAT قابلة للإفراز. مول. هناك. 17, 334–342 (2009).

Shaner ، N.C ، Steinbach ، P. A. & amp Tsien ، R. Y. دليل لاختيار البروتينات الفلورية. نات. أساليب 2, 905–909 (2005).

إسبينا ، في وآخرون. التقاط الليزر الدقيق. نات. بروتوك. 1, 586–603 (2006).

Legres، L.G، Janin، A.، Masselon، C. & amp Bertheau، P. ما وراء تقنية التسليخ الدقيق بالليزر: اتبع طريق الطوب الأصفر لأبحاث السرطان. أكون. J. السرطان الدقة. 4, 1–28 (2014)

فيكتورا ، جي دي وآخرون. تم الكشف عن ديناميات المركز الجرثومية بواسطة الفحص المجهري متعدد الفوتونات مع مراسل الفلورسنت المنشط ضوئيًا. زنزانة 143, 592–605 (2010).

Medaglia ، C. وآخرون. إعادة البناء المكاني للمنافذ المناعية من خلال الجمع بين المراسلين الناشطين ضوئيًا و scRNA-seq. علم 358, 1622–1626 (2017).

جلعادي ، أ. وآخرون. تشريح الحديث المتبادل الخلوي عن طريق تسلسل الخلايا المتفاعلة فيزيائيًا. نات. التكنولوجيا الحيوية. 38, 629–637 (2020).

باسكوال ، ج وآخرون. مراقبة تفاعلات الخلايا التائية الخلوية في الجسم الحي عن طريق وضع العلامات الأنزيمية بين الخلايا. طبيعة سجية 553, 496–500 (2018).

هيدلي ، إم ب وآخرون. تصور الاستجابات المناعية الفورية للخلايا النقيلية الرائدة في الرئة. طبيعة سجية 531, 513–517 (2016).

كالفو ، إف وآخرون. مطلوب النقل الميكانيكي وإعادة تشكيل المصفوفة المعتمدة على YAP لتوليد وصيانة الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. نات. خلية بيول. 15, 637–646 (2013).

باسارو ، د. وآخرون. تساهم زيادة نفاذية الأوعية الدموية في البيئة المكروية لنخاع العظام في تطور المرض والاستجابة للأدوية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد. الخلايا السرطانية 32، 324–341.e6 (2017).

Passaro ، D. ، Abarrategi ، A. ، Foster ، K. ، Ariza-McNaughton ، L. & amp Bonnet ، D. الهندسة الحيوية لبيئات نخاع العظم المتوافقة مع البشر في الماوس وتصورها عن طريق التصوير الحي. J. فيس. إكسب. 2017, 55914 (2017).


استكشاف الأخطاء وإصلاحها

المشكلة 1

انفصال المقاطع عن الشريحة الزجاجية المشحونة (الخطوة 3).

الحلول الممكنة

عند إجراء عمليات غسل رأسية (في برطمانات تلطيخ كوبلين الزجاجية) ، من الممكن أن تبدأ أقسام الأنسجة في الانفصال. لمنع هذا ، يمكن أخذ العديد من الأساليب في الاعتبار:

الحل 1: أثناء قص الأقسام في ناظم البرد ووضعها على الشرائح الزجاجية ، يجب حفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 & # x000a0min إلى 1 & # x000a0h لتعزيز الالتصاق الكامل لقسم الأنسجة بالزجاج.

الحل 2: يمكن استخدام شرائح مثل APES (aminopropyltriethoxysilane) (بدلاً من شرائح SuperFrost & # x02122 Plus) لزيادة التصاق الأنسجة (https://theolb.readthedocs.io/en/latest/molecular-biology/apes- علاج الشرائح. html).

الحل 3: قبل البدء في التلوين ، يجب إعطاء وقت كافٍ للشرائح لتكون في درجة حرارة الغرفة ، للتأكد من أن الأقسام متصلة تمامًا بالشرائح الزجاجية.

الحل 4: إذا لم يتم إصلاح الأنسجة بالفعل ، فقم بالتثبيت باستخدام PFA على الشريحة لتعزيز المزيد من الالتصاق.

الحل 5: أثناء إجراء التلوين ، استبدل المخزن المؤقت برفق بين الغسلات ، وعند استخدام الاهتزاز ، حدد سرعة منخفضة.

الحل 6: إذا استمرت الأقسام في الانفصال ، فقم بتنفيذ جميع عمليات الغسيل أفقيًا بطريقة الإسقاط.

المشكلة 2

تم الكشف عن إشارة عالية الفلورة في الأقسام التي تم تحضينها مع السكر الهابتينيك (الضوابط المثبطة) (الخطوة 14 أو 25).

الحل المحتمل

إذا كان ارتباط الليكتين بوساطة الكربوهيدرات ، عن طريق احتضان الليكتين بسكره الهابتين ، سيشغل السكر الهابتين موقع ربط الليكتين ويمنع الليكتين من الارتباط بالجليكان في الأنسجة ، مما يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في الإشارة في تلك الأقسام (كاملة لا ينبغي توقع الإلغاء دائمًا). استشر تعليمات الشركة المصنعة و # x02019s لتأكيد أنسب أنواع السكر للاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن منع بعض الليكتينات إلا عن طريق السكريات المعقدة وليس السكريات الأحادية ، حيث يجب استخدام البروتينات السكرية الجليكوزيلاتي بشكل مناسب (Brooks and Hall ، 2012). إذا لم يتم تقليل ارتباط الليكتين بشكل كبير في وجود السكر الهابتين ، فإن ارتباط الليكتين يكون إما غير محدد أو يتم توسطه بواسطة مواقع الربط غير الكربوهيدراتية الموجودة في الليكتين (Gerlach، et & # x000a0al.، 2012). يجب اختيار محاضرة مختلفة ذات خصوصية مرغوبة مماثلة في الحالة الأخيرة.

مشكلة 3

تلطيخ خلفية عالية / إشارة مضان (الخطوة 14 أو 25).

الحل المحتمل

إذا تم اكتشاف تلطيخ خلفية عالية ، فهناك عدة خطوات يمكن تجربتها لتقليلها. يمكن أن يكون هذا بسبب عدة أسباب:

السبب 1: الحجب غير الكافي لمواقع الربط غير المحددة ، والتي يمكن التغلب عليها عن طريق زيادة تركيز BSA المعالج بالدورات أو عن طريق تمديد فترة الحضانة لخطوة الحجب.

السبب 2: زيادة تركيز الليكتين أو درجة حرارة الحضانة أو وقت الحضانة. In these cases, it is advised to reduce the concentration of lectin and/or to incubate sections at 4ଌ instead of at room temperature and/or for a reduced period of time. Also, the lectin used could be potentially diluted in a buffer containing the blocking agent (e.g., 0.1% periodate-treated BSA in TBS-T or TBS). The use of other blocking agents (such as normal serum, which is frequently used in immunohistochemistry) is not appropriate as it possesses multiple glycosylated molecules, which might inhibit specific binding of lectins to the tissue or cause non-specific binding.

Reason 3: Number and duration of washes are too short. These can be increased to ensure that any lectin that is non-specifically bound is removed.

Reason 4: The tissue might have physiological structures/molecules that can cause auto fluorescence due to endogenous fluorophores (e.g., lipofuscin) (Croce and Bottiroli, 2014). To solve this problem, it is crucial to know the features and composition of the tissue and try to address them by finding a specific compound that can bind to these structures and reduce their auto fluorescence.

Problem 4

No fluorescence signal is detected in the stained tissue sections (step 14 or 25).

Potential solution

Lack of fluorescence signal in the samples might be caused by multiple factors:

Factor 1: Not enough lectin is bound to glycans of interest, for which the recommended course of action would be to use a higher concentration of lectin, to incubate it during a longer period (e.g., 2 h or even 3 h) or to incubate it at a higher temperature (e.g., at 37ଌ).

Factor 2: The lectin might have been improperly stored (e.g., kept at room temperature for long periods or in an environment not protected from light), which could lead to quenching of its signal or loss of its function. To ensure that the lectin has kept its function and labeling, a positive control should be run in parallel in every staining experiment. This positive control should be a tissue known to express the glycosylation motif specific to that lectin as characterized by the literature or based on previous in-house experiments.

Factor 3: The specific glycosylation motif might not be present in the tissue sample. To confirm this, a positive control using a sample where this glycosylation motif has been reported to be found should always be run in parallel.

Factor 4: The fixation procedure may modify the glycan structure that is necessary for recognition by the lectin. To solve this issue, a shorter fixation period or a different fixation method are recommended.

Factor 5: TBS buffer might be contaminated with bacteria, which might alter its properties and compromise the staining and functions of the lectin. For this, it is advised to only use freshly prepared sterile-filtered or autoclaved TBS.

Problem 5

The positive signal associated with the glycan distribution is not homogenous across the tissue section (step 14 or 25).


Z.Y. and J.L. contributed equally to this work. Conceptualization — X.C., X.Z., and H.W.O. Supervision — X.C. and H.W.O. Investigation — Z.Y., J.L., W.Z., M.L., R.L., B.Z., Y.C., and Y.H. Formal Analysis — J.L. and R.Y. Methodology — K.Z., C.F., and C.A. Writing–Original Draft — Z.Y. and J.L. Writing–Review & Editing — A.E., J.Z., and H.W.O. Funding Acquisition — X.C., B.W., and H.W. All authors read and approved the manuscript.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


شاهد الفيديو: المواد الاولية لعملية البناء الضوئي (قد 2022).