معلومة

لماذا لا يوجد U3 snRNP في مجمع spliceosome لبدء النسخ؟

لماذا لا يوجد U3 snRNP في مجمع spliceosome لبدء النسخ؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

snRNP U1 ، U2 ، U4 ، U5 ، U6 موجودة في spliceosome ولكن لا يوجد ذكر لـ U3.


يتم ترجمة U3 RNA ببروتيناته التي تشكل معقدًا في النواة. يعد شكل المربع C '/ D في U3 snRNA مسؤولاً عن هذا التوطين. لذلك ليس لدى U3 snRNA فرصة للذهاب إلى المواقع النشطة لنسخ mRNA. بدلاً من ذلك ، يلعب U3 snRNP أدوارًا مهمة في معالجة ribosomal-RNA. بسبب التوطين النكليولار ، يطلق على U3 snRNA اسم U3 snoRNA بدلاً من ذلك.

https://en.wikipedia.org/wiki/Small_nucleolar_RNA_U3


ضع في اعتبارك أن جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا نشأت عن طريق الانقسام من بويضة واحدة مخصبة ، وبالتالي ، فإن جميعها لها نفس الحمض النووي. ينتج عن تقسيم تلك البويضة المخصبة الأصلية ، في حالة البشر ، أكثر من تريليون خلية بحلول الوقت الذي يتم فيه إنتاج طفل من تلك البويضة (هذا هو الكثير من تكرار الحمض النووي!). ومع ذلك ، نعلم أيضًا أن الطفل ليس كرة عملاقة من تريليون خلية متطابقة ، ولكن لديه العديد من الأنواع المختلفة من الخلايا التي تشكل أنسجة مختلفة مثل الجلد والعضلات والعظام والأعصاب. كيف يمكن للخلايا التي لها حمض نووي متطابق أن تبدو مختلفة جدًا ولها وظائف مختلفة؟

تكمن الإجابة في تنظيم التعبير الجيني ، وهي عملية استخدام المعلومات المخزنة في الحمض النووي لتوليد بروتينات مختلفة من خلال خطوات العقيدة المركزية في علم الأحياء. على الرغم من أن جميع الخلايا في الطفل لها نفس الحمض النووي ، فإن كل نوع خلية مختلف يستخدم مجموعة فرعية فريدة من الجينات في الحمض النووي لتوجيه توليف مجموعة مميزة من الحمض النووي الريبي والبروتينات. الخطوة الأولى في التعبير الجيني هي النسخ.

ما هو النسخ؟ النسخ هي عملية نسخ المعلومات من تسلسل الحمض النووي إلى تسلسل الحمض النووي الريبي. تُعرف هذه العملية أيضًا باسم تخليق الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي. عندما يتم نسخ تسلسل من الحمض النووي ، يتم نسخ جزء واحد فقط من أحد خيوط الحمض النووي إلى RNA ، وهذا يتناقض مع عملية تكرار الحمض النووي (الفصل 14) حيث يجب نسخ كل من خيوط الحمض النووي ، وفي مجملها

نسخ نسخ امتدادات قصيرة من مناطق الترميز (تسلسل الحمض النووي الذي يتم تحويله في النهاية إلى بروتينات) من الحمض النووي لتوليد الحمض النووي الريبي. في البشر ، يمكن أن يبلغ متوسط ​​هذه الامتدادات القصيرة حوالي 8.5 كيلو قاعدة (kb) وتتكون من كل من exons و introns. تحتوي الإكسونات على المعلومات اللازمة لصنع البروتينات ، أما الإنترونات فهي غير مشفرة ، متداخلة ، تسلسل الحمض النووي. يمكن نسخ جينات مختلفة إلى RNA في أوقات مختلفة في دورة حياة الخلية. RNAs هي نسخ مؤقتة من تعليمات المعلومات الموجودة في DNA ويتم نسخ مجموعات مختلفة من التعليمات لاستخدامها في أوقات مختلفة.

الجدول 3-1: الملامح العامة للنسخ.

تُعرف عملية صنع نسخ الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي كقالب باسم النسخ

تنتج عملية النسخ جميع أنواع الحمض النووي الريبي (mRNA ، و tRNA ، و rRNA ، إلخ)

يعمل خيط واحد من الحمض النووي كقالب لتركيب الحمض النووي الريبي

تسمى الإنزيمات التي تصنع الحمض النووي الريبي RNA polymerases

تقوم بوليميرات الحمض النووي الريبي بتجميع الحمض النووي الريبي في اتجاه 5 إلى 3

لا تحتاج بوليميرات الحمض النووي الريبي إلى مادة أولية

يستخدم RNA polymerases rNTPs (ATP و GTP و UTP و CTP) لبناء حبلا RNA جديد

ترتبط بوليميرات الحمض النووي الريبي بتسلسلات معينة من الحمض النووي تسمى المحفزات لبدء النسخ

توقف بوليميرات الحمض النووي الريبي تخليق الحمض النووي الريبي عندما تصل إلى تسلسلات تسمى النهايات

تصنع الخلايا عدة أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي (RNA):

رسول RNA : mRNAs التي ترمز للبروتينات

RNA الريبوسوم : الرنا الريباسي التي تشكل جزءًا من الريبوسومات

نقل الحمض النووي الريبي : tRNAs التي تحمل الأحماض الأمينية إلى الريبوسوم أثناء الترجمة

ميكرو آرنا s: miRNAs التي تنظم التعبير الجيني

العديد من الرناوات الصغيرة الأخرى التي لها مجموعة متنوعة من الوظائف الفريدة ، غالبًا ، ولكن ليس دائمًا ، تلعب دورًا في تنظيم التعبير الجيني (مثل snRNA و snoRNA و TERC و lncRNA و piRNA و siRNA و shRNA)

الجدول 3-2: أنواع بوليميرات الحمض النووي الريبي الموجودة في حقيقيات النوى وبعض الحمض النووي الريبي الذي يقومون بنسخه.

إن بناء خيط RNA يشبه إلى حد بعيد بناء خيط DNA. هذا ليس مفاجئًا ، مع العلم أن كل من DNA و RNA كلاهما من الأحماض النووية ، وبالتالي فهي متشابهة جدًا من الناحية الهيكلية. في الواقع ، الاختلافات الرئيسية الثلاثة بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي هي: 1) وجود مجموعة 2'-OH على سكر الريبوز في الحمض النووي الريبي 2) اليوراسيل وليس الثايمين هو أحد القواعد النيتروجينية للبيريميدين في الحمض النووي الريبي و 3) الحمض النووي مزدوج - تقطعت بهم السبل بينما تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الناتج عن النسخ. يتم تحفيز النسخ بواسطة الإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي ، وهو مصطلح عام للإنزيم الذي يصنع بوليمر RNA. هناك بوليميرات مختلفة من الحمض النووي الريبي في حقيقيات النوى المسؤولة عن تصنيع العديد من الحمض النووي الريبي المختلف الموجود في الخلايا (الجدول 3-2).

الشكل 3-1: بوس توروس بوليميراز الحمض النووي الريبي II. يظهر البروتين في الحمض النووي باللون الفوشيا وهو البنية الحلزونية المزدوجة الموضحة في البروتين. يتكون العمود الفقري للحمض النووي من اللون البرتقالي والوردي الفاتح. لا يمكن رؤية الحمض النووي الريبي الذي يتم تصنيعه جيدًا من هذه الزاوية ولكنه يخرج من الجزء الخلفي من بنية البروتين.

مثل بوليميرات الحمض النووي ، تبني بوليمرات الحمض النووي الريبي جزيئات جديدة من الحمض النووي الريبي في الاتجاه 5 & # x27 إلى 3 & # x27 ، ولكن نظرًا لأنها تصنع الحمض النووي الريبي ، فإنها تستخدم ريبونوكليوتيدات (أي نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي) بدلاً من ديوكسي ريبونوكليوتيدات (كما في الحمض النووي). يتم ربط الريبونوكليوتيدات بنفس الطريقة تمامًا مثل deoxyribonucleotides ، وهذا يعني أن 3 & # x27-OH من النوكليوتيدات الأخيرة على الخيط مرتبط بالفوسفات 5 & # x27 للنيوكليوتيدات الواردة.

يتمثل أحد الاختلافات الجوهرية بين بوليميرات الحمض النووي وبوليميرات الحمض النووي الريبي في أن الأخير لا يتطلب مادة أولية لبدء صنع الحمض النووي الريبي. بمجرد أن تكون بوليميرات الحمض النووي الريبي في المكان المناسب لبدء نسخ الحمض النووي ، فإنها تبدأ فقط في تصنيع الحمض النووي الريبي عن طريق توتير نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي معًا المكملة لقالب الحمض النووي. تُعرف حقيقة أن بوليميرات الحمض النووي الريبي يمكنها نسخ الحمض النووي بدون مادة أولية من جديد تخليق الحمض النووي الريبي ، بمعنى توليف الحمض النووي الريبي "يبدأ من البداية". في المقابل ، يتطلب تكرار الحمض النووي وجود مادة أولية لبدء تخليق الحمض النووي (الفصل 14).

الشكل 3-2: بنية الحمض النووي الريبي . تمتلك RNAs مجموعة هيدروكسيل في 2’-carbon ، بينما الحمض النووي ليس كذلك. تستخدم RNAs القاعدة النيتروجينية ، على عكس الحمض النووي ، الذي يستخدم الثايمين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إنشاء الخيط في اتجاه 5 'إلى 3' (في اتجاه السهم الأحمر) ، عند إضافة النوكليوتيدات الواردة ، إنه 5 'فوسفات مرتبط بـ 3'OH من النيوكليوتيد الذي تم دمجه بالفعل في حبلا RNA.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


لماذا لا يوجد U3 snRNP في مجمع spliceosome لبدء النسخ؟ - مادة الاحياء

للتحقيق في آلية تجميع spliceosome في الجسم الحي ، أجرينا تحليل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) لجزيئات البروتين النووي الصغيرة U1 و U2 و U5 (snRNPs) إلى الخميرة المحتوية على intron (S. cerevisiae) الجينات. تعرض snRNPs الأنماط التي تشير إلى نموذج تجميع النسخ المتماثل: U1 أولاً ، ثم U2 ، و U4 / U6 • U5 ثلاثي snRNP متبوعًا بزعزعة استقرار U1. رابطة الدول المستقلةتدعم طفرات الربط أيضًا دور U2 و / أو tri-snRNP في زعزعة استقرار U1. علاوة على ذلك ، يشيرون إلى أن كفاءة الربط لها تأثير كبير على توظيف snRNP التماثل للنسخ ويقترحون أن التوظيف المشترك لـ U2 أو tri-snRNP مطلوب لإلزام pre-mRNA بالربط. كان لطفرات نقطة التفرع (BP) تأثير كبير على نمط U1 ، بينما كان لطفرات موقع لصق 5 (5′ss) تأثير أقوى على نمط U2. تشير تجربة تكميلية 5′ss-U1 snRNA إلى أن الاقتران بين U1 و 5′ss يحدث بعد توظيف U1 ويساهم في تشكيل U1 محدد: الركيزة المطلوبة للتوظيف الفعال U2 و tri-snRNP.


دورة التحفيز الجسيمي

يتعرف U1 و U2 snRNPs على مواقع لصق 5 & # x02032 و 3 & # x02032 (5 & # x02032SS و 3 & # x02032SS) ومواقع الفروع المحفوظة (BS: AG) للإنترونات. يتبع BS مسار بولي بريميدين (PPT) المنبع من 3 & # x02032SS في metazoans. يتم حفظ BS و PPT بشكل سيئ في النباتات (Brown and Simpson ، 1998 Simpson et al. ، 2002) ، على الرغم من وجود أخصائيي تقويم العظام لبروتينات U2AF و PTB المتفاعلة مع BS في النباتات. أرابيدوبسيس. في المختبر تشير دراسات التجميع إلى أن U1 snRNP يرتبط أولاً عبر U1-C و U1-70K بـ 5 & # x02032SS. بعد ذلك ، يرتبط PPT و 3 & # x02032SS على التوالي بالعوامل المساعدة U2 U2AF65 و U2AF35 التي تتفاعل مع SF1 في BP ، وكذلك مع مجموعة من بروتينات SR و hnRNP و Transformer (Tra) و EJC التي تتعرف على exonic و intronic مُحسِّن الربط وتسلسلات كاتم الصوت ، مما يساهم في تعريف exons & # x02019 مواضع (للمراجعة ، راجع Will and L & # x000FChrmann، 2011). ذات الصلة SR أرابيدوبسيس يتفاعل عامل SR45a / Tra-2b ، على سبيل المثال ، مع U1-70K و U2F35a للمساعدة في اختيار موقع لصق ، وكذلك مع PRP38 أثناء تنشيط spliceosome (Tanabe et al. ، 2009). من 19 أرابيدوبسيس تم تصنيف بروتينات SR إلى سبع فصائل فرعية (Barta et al. ، 2010) ، وخميرة وتقويم العظام البشرية من SR1 و SC35 و RS33 و RSZ33 ، بالإضافة إلى البروتينات المرتبطة بـ SR Tra-1A و B1 / 2 و SRm160. في مجمعات لصق نقية (الجدول S1 في المواد التكميلية). يتم تنظيم النسخ والتضفير البديل لجينات البروتين SR من خلال العديد من الإجهاد والمحفزات الهرمونية ، وتؤدي طفراتها المعروفة إلى عيوب تنظيمية متعددة الاتجاهات (ريدي ، 2007). يتم تنظيم نشاط واستقرار بروتينات SR من خلال الفسفرة بما في ذلك عائلات كينازات Lammer / CLK و SRPK1 و SRPK2 ، بالإضافة إلى العديد من ميثيلات الأرجينين PRMT التي تتعرف أيضًا على الفئات الأخرى (على سبيل المثال ، Sm ، Lsm ، hnRNP ، إلخ.) من البروتينات الوراثية (فلوهر ، 2008). أرابيدوبسيس تم إثبات PRMT5 مؤخرًا لميثيل العديد من عوامل Sm و LSm (Deng et al. ، 2010). ال prmt5 تؤدي الطفرة إلى حدوث خلل في التضفير FLK / hnRNP-E pre-mRNA والتزهير المتأخر عن طريق زيادة FLC مستوى النسخ ، وكذلك يغير التعرف على 5 & # x02032SS مما يؤدي إلى معالجة شاذة لمكونات ترميز ما قبل mRNAs للساعة اليومية (Sanchez et al. ، 2010).

يتم تثبيت تفاعل U1 مع U2 snRNP المعين من U2AF بواسطة DExH / D-box RNA helicase Prp5 المعتمد على ATP. يتم تحفيز إزاحة SF1 بواسطة الوحدة الفرعية SF3b14a لمركب U2-SF3a / b المرتبط بـ PPT بواسطة Prp5 مما يؤدي إلى تكوين مركب قبل الجسيم A (Behzadnia et al. ، 2007 الشكل 2). يسهل Prp5 أيضًا تلدين U2 snRNA باستخدام BS ، والذي يؤدي إلى انتفاخ بقايا A من الإنترون لتفاعل الاسترة التبادلية الأول. يؤدي التوظيف اللاحق لـ U4 / U6.U5 ثلاثي snRNP إلى تجميع U1 / 2/4/5/6 penta-snRNP في المجمع التحفيزي B (Deckert et al. ، 2006). يمكن تنقية Penta-snRNP من الخميرة ولكنها غير نشطة وتتطلب عوامل إضافية ، خاصة NTC ، لتكوين مركب B ACT المنشط (Stevens et al. ، 2002).

الشكل 2. عرض تخطيطي للتجميع لصقيا والدورة التحفيزية. تم رسم المخطط وفقًا لـ Wahl et al. (2009) يشير إلى الأدوار التنظيمية المحددة لمرحلة التجميع من هليكازات DExH / D-box RNA المعتمدة على ATP (باللون الأحمر) ومجمع NTC المنشط للجبس. 5 & ​​# x02032 و 3 & # x02032 موقع لصق (5 & # x02032SS و 3 & # x02032SS) ، ونقطة التفرع (BP) ، ومسالك بولي بريميدين (PPT). يشار إلى Exons بواسطة مربعات رمادية ، بينما تُظهر الخطوط السوداء الرفيعة intron و intron lariat.

أثناء الانتقال المعقد من B إلى B ACT ، تمت مقاطعة تفاعل U1 و U1-C مع 5 & # x02032SS بواسطة هليكاز Prp28 / U5-100 ، والذي يتم تنشيطه بواسطة U4 / U6.U5 ثلاثي snRNP كيناز SRPK2. بعد ذلك ، يؤدي فك تشفير U4 / U6 snRNAs بواسطة Brr2 / U5-200 Helicase إلى تسهيل تفاعلات U6 snRNA مع 5 & # x02032SS و U2 snRNA. هذا يحفز إطلاق بروتينات U1 و U4 snRNPs وبروتينات U6 الخاصة بـ Lsm و Prp24 ، بالإضافة إلى تكوين حلقة جذعية داخل الجزيئية (ISL) في U6 ، والتي تمثل المركز الحفاز المرتبط بالمعادن في الجسيم العضوي. يتم التحكم في Brr2 بواسطة الوحدة الفرعية Snu114 GTPase و Prp8 U5. تؤدي إزالة بروتينات SF3a / b المرتبطة بـ U2 بواسطة Prp2 هيليكاز إلى كشف BS في المركب B * النشط الحفاز المعاد تشكيله. أثناء الخطوة الأولى من الربط ، تهاجم بقايا الأدينوزين 2 & # x02032-OH من BS وتشكل رابطة تساهمية مع U6 ISL-cleaved 5 & # x02032SS مما ينتج عنه 5 & # x02032-exon و lariat intron-3 & # x02032exon وسيطة.

يعتمد التنشيط التحفيزي للجسيم الوراثي بشكل حاسم على ارتباطه بـ NTC قبل أو أثناء فك U4 و U6 snRNAs. ينظم NTC تفاعلات U5 و U6 مع pre-mRNA قبل وبعد الخطوة الأولى ، بالإضافة إلى تكوين مركز التحفيز spliceosome & # x02019s (Chan et al.، 2003 Chan and Cheng، 2005). يتطلب هجوم Nucleophilic لـ 3 & # x02032-OH لـ 5 & # x02032 exon في 3 & # x02032SS في الخطوة الثانية مزيدًا من إعادة الترتيب الهيكلي بواسطة عوامل متعددة تؤدي إلى تكوين مركب C. يشارك وسيط exon (Grainger and Beggs ، 2005) ، و Prp16 ATPase ، والوحدة الفرعية NTC Isy1 في مراقبة إكمال الخطوة الأولى وإزاحة U6 من 5 & # x02032SS لتحريره للخطوة التحفيزية II. يتم وضع كل من هليكاز Prp18 والحلقة 1 من U5 snRNA جنبًا إلى جنب لربط 5 & # x02032 exon و 3 & # x02032SS المرتبطين بوحدتي NTC المتفاعلتين Slu7 و Prp22 helicase (Smith et al. ، 2008). بعد ذلك ، يعطل Prp22 المودعة في اتجاه مجرى تقاطع exon & # x02013exon تفاعل Prp8 و U5 مع تسلسلات exon ، مما يؤدي إلى إطلاق mRNA المقسم من C. الجينات المرشحة في أرابيدوبسيس، بينما يُعتقد أن Brr2 و Snu114 يعملان على فك وفصل مكونات U2 و U6 في مجمع ما بعد الربط (Valadkhan and Jaladat ، 2010).


التعبير الجيني: نسخ الكود الجيني

نهاية

يتضمن إنهاء نسخ الحمض النووي الريبي تسلسلات محددة في اتجاه مجرى الجين الفعلي حتى يتم نسخ الحمض النووي الريبي. هناك نوعان من آلية الإنهاء - الإنهاء الجوهري و rho (ρ) - الإنهاء المستقل. بالنسبة للإنهاء الجوهري ، يمكن أن تشير المناطق الموجودة في نهاية الجينات التي تسمى مواقع الإنهاء أو مواقع النهاية إلى إنهاء النسخ. تتميز مواقع الإنهاء بتكرارين معكوسين متباعدتين ببعض القواعد الأخرى (الشكل 3.10). ثم يقوم الحمض النووي بتشفير سلسلة من اليراسيل. عندما يتم إنشاء الحمض النووي الريبي ، فإن التكرارات المقلوبة تشكل حلقة دبوس الشعر. هذا يميل إلى إعاقة تقدم RNA polymerase. وفي الوقت نفسه ، فإن وجود اليوراسيل يسبب سلسلة من أزواج قاعدة A-U بين حبلا القالب والحمض النووي الريبي. نظرًا لأن أزواج قاعدة A-U بين حبلا القالب والحمض النووي الريبي مرتبطة بشكل ضعيف بالهيدروجين مقارنة بأزواج G-C ، فإن RNA ينفصل عن فقاعة النسخ وينهي النسخ.

الشكل 3.10. ميزات تسلسل النهاية الجوهرية - التكرارات المقلوبة وسلسلة من uracils.

يتضمن الإنهاء المعتمد على تكرارًا مقلوبًا ، لذلك يتسبب أيضًا في تكوين حلقة دبوس شعر ولكن لا توجد سلسلة من U. في هذه الحالة ، يرتبط البروتين بالحمض النووي الريبي ويطارد البوليميراز (الشكل 3.11). عندما يقوم البوليميراز بنسخ الحمض النووي الريبي الذي يشكل حلقة دبوس الشعر ، فإنه يتوقف ، مما يمنح البروتين فرصة للحاق بالركب. عندما يصل البروتين إلى موقع الإنهاء ، فإنه يسهل تفكك آلية النسخ. نتيجة التفكك تنهي النسخ.

الشكل 3.11. إنهاء النسخ المعتمد على Rh.


نتائج ومناقشة

تحديد البروتينات التي تتفاعل مع CBC

لتحديد شركاء تفاعل البروتين لـ CBC ، تم إنشاء خط خلية هيلا المعدلة وراثيًا يعبر بشكل ثابت عن CBP20 بعلامة GFP C ، باستخدام إعادة تجميع الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC). تقدم عملية ترانسجينيسين BAC ميزة أن & # x0201cthird allele & # x0201d الذي يشفر البروتين ذي العلامات يتم التعبير عنه على المستويات الفسيولوجية ، بسبب استخدام العناصر التنظيمية الذاتية ، وعلامة GFP فعالة في التنقية المناعية وقياس الطيف الكتلي (Poser et al. 2008 ). يتم ترجمة CBP20-GFP بشكل صحيح إلى النواة ويربط كل من أغطية m 7 G و CBP80 (الشكل التكميلي 1A Pabis et al. 2010). تمت معالجة محلولات الخلايا بالبنزوناز لتحطيم الحمض النووي والحمض النووي الريبي قبل التنقية المناعية ، وبالتالي تقليل اكتشاف البروتينات المرتبطة بـ CBC من خلال الأحماض النووية (Cheeseman and Desai 2005 Pabis et al. 2010). يسرد الجدول 1 البروتينات المحددة على وجه التحديد من كل من شريحة الهلام ومستحضرات البندقية (انظر الجدولين التكميليين 1 و 2 لمجموعات البيانات الكاملة). كما هو متوقع ، كانت البروتينات المكتشفة بقوة مع CBP20 هي CBP80 و ARS2 و PHAX والمستوردات ومكونات مجمع الاستهداف الخارجي النووي (NEXT) (Lubas et al. 2011).

الجدول 1.

تفاعلات البروتين لـ CBP20-GFP

تضمنت أكبر مجموعة من العوامل المشتركة مع CBP20 15 U1 و U2 و U5 و U4 / U6 و U4 / U6 & # x000b7U5 بروتينات خاصة بـ snRNP. كان التعرف على هذه البروتينات محددًا للغاية ، نظرًا لأن العديد من البروتينات الموجودة تقريبًا في 200 بروتين الموجودة في لصق الثدييات (Wahl et al. 2009) لم يتم اكتشافها علاوة على ذلك ، كانت عوامل الربط غير snRNP عالية الوفرة (على سبيل المثال ، بروتينات SR) غائبة. على الرغم من حقيقة أن snRNPs المحتوية على U4- و U5- و U6 أقل وفرة 10 مرات من U1 و U2 snRNPs (Yu et al. 1999) ، كان عدد الببتيدات التي تمثل مكونات U4 / U6 & # x000b7U5 snRNP مرتفعًا بشكل ملحوظ ( الجدول 1 ). وبالتالي ، تشير البيانات إلى أن CBC يرتبط بجميع snRNPs المتصلبة ، من بينها U4 / U6 & # x000b7U5 snRNP على وجه الخصوص.

ركزنا على تفاعلات CBC مع snRNPs للتحقق من صحتها عن طريق الترسيب المناعي المشترك ، باستخدام خطوط الخلايا المعدلة وراثيًا التي تأوي مرشحين بعلامات GFP (انظر الشكل التكميلي 1A & # x02013C Sapra et al. 2009). من الممكن أن ترتبط العديد من البروتينات التي تترافق مع الراسب المناعي مع CBC بشكل غير مباشر إما من خلال (قبل) mRNA أو من خلال snRNAs الموجودة في snRNPs. إن هضم RNase قادر على إزالة كلا النوعين من RNA وبالتالي إلغاء التفاعلات التي تتم بوساطة RNA على سبيل المثال ، نظهر أن U1 snRNP يتم تعطيله بواسطة RNase (الشكل التكميلي 1E Sapra وآخرون 2009). لذلك ، عولجت lysates الخلوية مع RNase A أو بدونه ، وتم فحص مادة مشتركة لـ CBP20 و CBP80 غير الموسومة عن طريق النشاف الغربي (الشكل 1 ، اللوحة العلوية التكميلية الشكل 1 د). كما هو متوقع ، كانت ارتباطات CBP20 مع CBP80 و ARS2 غير حساسة لـ RNase (الشكل التكميلي 1D). وبالمثل ، فإن CBC coimmunoprecipitated مع المكون المركب NEXT ZC3H18 / NHN1 من كل من مستخلصات الخلايا الوهمية والمعالجة بـ RNase (الشكل 1). تشير هذه الملاحظة ، جنبًا إلى جنب مع التقرير الذي يربط NHN1 بـ mRNPs بطريقة تعتمد على CBC (Merz et al. 2007) ، إلى الدور المحتمل لـ CBC في تجنيد NHN1 في mRNP في الجسم الحي.

التحقق من ارتباط عامل الربط بـ CBC. (العلوي لوح) مقتطفات من خلايا هيلا المعدلة وراثيا التي تؤوي عوامل الربط الموسومة بـ GFP ، المشار إليها اليسار من اللوحة ، مع أو بدون RNase A وتعرضت لهطول مناعي باستخدام & # x003b1-GFP. تم تحليل 0.6٪ من المدخلات (Inp) و 33٪ من الراسب المناعي بواسطة لطخة غربية ، باستخدام & # x003b1-CBP20 و & # x003b1-CBP80. تم تقييم الخلفية غير المحددة عن طريق الترسيب المناعي مع IgG غير المناعي (IgG). انظر الشكل التكميلي 1 ، D و E ، للحصول على بيانات إضافية وأدلة على أن علاج RNase قد عطل snRNPs. (أدنى لوحة) مقتطفات من نفس خلايا هيلا المعدلة وراثيًا المعالجة بـ وبدون & # x003b1-amanitin لمنع نسخ Pol II ، كما هو محدد. تم إجراء جميع التجارب مرتين إلى أربع مرات لكل منها ، وتم عرض المواد الهلامية التمثيلية.

كان من الممكن التحقق من صحة تفاعلات U1 و U2 و U4 / U6 & # x000b7U5 snRNPs مع CBC ، على الرغم من أن العديد من بروتينات snRNP يبدو أنها مرتبطة بشكل غير مباشر بواسطة RNA (الجدول 1). على وجه التحديد ، U1 snRNP الموسومة بـ GFP (U1-70K ، U1A) ، U2 snRNP (SF3A1) ، و U4 / U6 & # x000b7U5 snRNP (U5-200K ، U4 / U6-60K ، U4 / U6-61K ، U5-116K ، و Prp8) قادرون على المشاركة في الترسيب المناعي CBP20 و CBP80 في غياب RNase (الشكل 1 ، اللوحة العلوية التكميلية الشكل 1D ، E). ومع ذلك ، تم تقليل الترسيب المناعي المشترك لـ U2AF65 و U1-70K و U1-A و SF3A1 بشدة بواسطة علاج RNase ، مما يشير إلى الارتباط من خلال snRNA أو pre-mRNA. في المقابل ، U5-200K (المتماثل البشري للخميرة Brr2 ، وهيليكاز RNA) ، U4 / U6-60K (hPrp4 ، بروتين متكرر WD) ، و U4 / U6-61K (hPrp31 ، رابط U4 snRNA و Nop البروتين المحتوي على المجال) بقي مرتبطًا بعد هضم RNase ، مما يشير إلى ارتباط RNA المستقل لـ U4 / U6 & # x000b7U5 snRNP مع CBC. لتحديد ما إذا كان النسخ النشط والربط مطلوبين بشكل صارم لتفاعلات snRNP مع CBC ، عالجنا الخلايا بـ & # x003b1-amanitin قبل تحلل الخلية. لم يؤدي تثبيط النسخ إلى تعطيل التفاعلات مع هذه البروتينات. تشير حساسية U1-70K إلى & # x003b1-amanitin (الشكل 1 ، اللوحة السفلية) إلى أن فقدان U1-70K عند معالجة RNase (الشكل 1 ، اللوحة العلوية) يرجع بالفعل إلى تعطيل U1 snRNP (إضافي الشكل 1E). يشير الاكتشاف المستمر لكل من CBP20 و CBP80 في الراسبات المناعية لبروتينات U1 و U4 / U6 و # x000b7U5 snRNP بعد تثبيط النسخ إلى أن snRNPs spliceosomal قد تكون مرتبطة بشكل أساسي بـ CBC. بدلاً من ذلك ، يمكن الحفاظ على هذه التفاعلات من خلال بقاء الحمض النووي الريبي غير المقسم في المستخلص. قد تفسر التفاعلات المستقلة عن النسخ والحمض النووي الريبي بين CBC و snRNPs سبب اكتشاف CBC في جزيئات لصق نقية مجمعة على mRNAs السابقة التي تفتقر إلى m 7 G caps (Fabrizio et al. 2009).

مجتمعة ، تشير هذه السلسلة من تجارب التحقق من الصحة إلى أن CBC يتفاعل بطريقة مستقلة عن RNA مع U4 / U6 & # x000b7U5 snRNP (الجدول 1). لا توجد تسلسلات للأحماض الأمينية أو أشكال بروتينية مشتركة بين هؤلاء الشركاء ، مما يجعل من الصعب التكهن بما إذا كان ارتباط CBC بهذه البروتينات يرجع إلى الارتباط المباشر. علاوة على ذلك ، لا يمكننا التمييز بين الارتباط بـ CBP20 و CBP80 في هذه التجارب. في هذه الدراسة ، سعينا إلى فهم دور CBC في الربط ، الأمر الذي يتطلب تجميع جسيمات لصق من snRNPs الناضجة. لذلك ، كنا نهدف إلى متابعة دور CBC في تجنيد snRNP في الجسم الحي ، بدلاً من التركيز على تفاعلات CBC مع البروتينات الفردية. للقيام بذلك ، قمنا بربط استنفاد CBC بواسطة RNAi بمقايسات محددة تستجوب تفاعلات snRNPs لصقية كاملة مع pre-mRNA.

لا تتأثر مستويات SnRNP باستنفاد CBC

كان علاج خلايا هيلا باستخدام الحمض النووي الريبي المتداخل الخاص بـ CBP80 بطريقتين مستقلتين فعالًا ، مما أدى إلى انخفاض & # x0223c80 ٪ في CBP80 mRNA ومستويات البروتين (الشكل 2 أ الشكل التكميلي 2 ب ، ج). الأهم من ذلك ، أدى استنفاد CBP80 أيضًا إلى انخفاض & # x0223c50 ٪ في مستويات البروتين CBP20 ، مما أدى إلى ضربة قاضية فعالة بشكل عام لكامل CBC بالكامل ويشير إلى أن استقرار CBP20 يتطلب CBP80. تتوافق هذه النتيجة والضعف الملحوظ في تكاثر الخلايا (الشكل 2 أ الشكل التكميلي 2 أ) مع دراسة سابقة (ناريتا وآخرون ، 2007). علاوة على ذلك ، لم تتغير مستويات التعبير لسبعة عوامل ربط مميزة & # x02014 بما في ذلك البروتينات المتوافقة مع CBC و U1-70K و SF3A1 و Prp8 و U5-116K & # x02014 عند ضربة قاضية لـ CBC (الشكل التكميلي 2D) ، مما يشير إلى أن استنفاد CBP80 لا يزعزع استقرار عوامل الربط بشكل عام.

لا تؤثر الضربة القاضية الفعالة لـ CBC على مستويات snRNP. تم فحص خلايا هيلا المنقولة بواسطة ناقلات الفيروسات القهقرية التي تعبر عن CBP80 shRNA أو بدون shRNA (التحكم) في اليوم 6. (أ) تقييم نضوب CBC من خلال النشاف الغربي الدلالي (اليسار لوحة) من CBP80 و CBP20 و GAPDH بعد ضربة قاضية CBP80 (دينار كويتي). تم تحميل كميات متناقصة من نفس المحللة. مقارنة التغيرات في CBP80 و CBP20 RNA ومستويات البروتين (حق لوجة). تم قياس شدة النطاق على أنها كثافات متكاملة من البقع الغربية وتم تطبيعها إلى GAPDH. تم تحديد مستويات الحمض النووي الريبي بواسطة RT-qPCR وتم تطبيعها إلى 18S rRNA. ن & # x02265 8 ضربات قاضية مختلفة. أشرطة الخطأ هي SEM. التغييرات ذات دلالة إحصائية (ص & # x0003c 0.005) ، وفقًا لما حدده الطالب & # x02019s ر-اختبار. (ب) الترسيب المناعي لـ snRNPs مع & # x003b1-TMG (K121) ، & # x003b1-Sm (Y12) ، و & # x003b1-SART3. تم استخلاص الحمض النووي الريبي ، وحلّه على هلام يوريا بنسبة 10٪ ، واكتشافه بواسطة لطخة شمالية. يتم عرض تعريض أطول لممرات IP & # x003b1-TMG.

نظرًا لأن شروط استنفاد CBC هذه قد تم تصميمها لاختبار تجميع الجسيمات وديناميكيات snRNP في فحوصات المصب ، فقد كنا قلقين من أن مستويات snRNP قد تتأثر. يتوسط ارتباط CBC و PHAX بـ snRNAs النووي المغطى بـ m 7 G يتوسط انتقالهما إلى السيتوبلازم ، حيث يحدث تجمع حلقة Sm وغطاء snRNA ثلاثي الميثيل (Izaurralde et al. 1995 Ohno et al.2000 Muller-McNicoll and Neugebauer 2013) . إذا كانت ضربة قاضية لـ CBC تضعف تصدير snRNA ، فقد تحدث تخفيضات في خطوات نضوج snRNP السيتوبلازمية وبالتالي مستويات snRNP الخلوية. ومع ذلك ، كشف النشاف الشمالي للحمض النووي الريبي الكلي أن مستويات snRNAs U1 و U2 و U4 و U6 كانت متشابهة بين الخلايا الضابطة والخلايا المستنفدة لـ CBC (الشكل 2 ب). الأهم من ذلك ، أن مستويات snRNP المجمعة التي تحتوي على بروتينات Sm وأغطية ثلاثي ميثيل غوانوزين (TMG) لم تتأثر. لم يكشف التقدير الكمي عن أي فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات U1 و U2 بين خلايا الضربة القاضية وخلايا التحكم (الشكل التكميلي 3 أ). نظرًا لأن snRNAs U4 و U6 لم يتم اكتشافهما جيدًا بواسطة اللطخة الشمالية ، فقد تم تحصين snRNAs U4 و U6 باستخدام & # x003b1-SART3 ، خاصة بـ U4 / U6 snRNP (Stanek et al. 2003). كان الكشف عن snRNAs U4 و U6 قويًا ولم يتغير بسبب استنفاد CBC (الشكل 2 ب الشكل التكميلي 3 أ). كما لم تتأثر مستويات U5 snRNA (الشكل التكميلي 3 ب). أدى هذا النقص المفاجئ في التأثير على مستويات snRNP إلى التحقق من ارتباط CBC و PHAX بـ pre-snRNAs ، قام كل من CBC و PHAX بسحب ما قبل snRNAs ، كما هو متوقع (الشكل التكميلي 3C). أخيرًا ، تم إجراء وضع العلامات الأيضية لاستجواب درجة snRNA 5 & # x02032-cap tri-methylation ولم يُظهر أي تغيير عند استنفاد CBC (الشكل التكميلي 3D). نستنتج أن المستويات المتبقية من CBC يجب أن تكون كافية لدعم التكوُّن الحيوي لـ snRNA في الخلايا المستنفدة. نظرًا لعدم تأثر مستويات snRNP التوصيلية الكلية ، كان من الممكن التحقيق في دور مميز لـ CBC في الربط.

يقلل استنفاد CBC من التضفير النسخي

اخترنا FOS الجين للتحقيق في دور CBC في التضفير النسخي وتجميع spliceosome للأسباب التالية. أولا، FOS يتم تقطيع النصوص بكفاءة بطريقة النسخ المتماثل (Listerman et al. 2006 Vargas et al. 2011). ثانيا، FOS محفز بشدة (بيشاكيزيك وبلانشارد 1994) ، مما يسمح بقياس النصوص المقسمة وغير المقسمة خلال فترة استنفاد CBC مع الحد الأدنى من الخلفية من الرنا المرسال المركب مسبقًا. ثالثًا ، قوي FOS النسخ عند الحث يسمح باكتشاف توظيف عامل الربط في وحدة النسخ عن طريق الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) (Listerman et al. 2006 Sapra et al. 2009). الرابعة ، FOS يتميز ببنية exon & # x02013intron بسيطة نسبيًا (الشكل 3 أ). هذه الميزات تجعل FOS جين مثالي لدراسة آثار استنفاد CBC على التضفير.

يقلل استنفاد CBC من تجميع وربط الجسيمات المتجانسة. تعرضت خلايا هيلا المنقولة بالتحكم و & # x003b1-CBP80 ناقلات الفيروسة الرجعية shRNA لعزل الحمض النووي الريبي ، ChRIP ، أو ChIP في اليوم 6. (أ) تمثيل تخطيطي لـ FOS pre-mRNA و mRNA ، يُظهران موقع أمبليكونات qPCR التي تكتشف الحمض النووي الريبي باستخدام intron 1 المقسم أو غير المقسم (الأزرق) والإنترون 3 (الأحمر). مجموع الحمض النووي الريبي (اليسار لوحة) تم نسخها عكسيًا باستخدام جهاز تمهيدي oligo (dT) والوفرة النسبية من التقسيم إلى poly (A) + RNA غير المقسم بواسطة qPCR. الوليدة RNA (حق لوحة) بواسطة ChRIP من & # x003b1-AcH4 IP والنسخ العكسي ، باستخدام التمهيدي في intron 2 (لربط intron 1) أو في exon 4 (لربط intron 3). تم إجراء qPCR لتقييم الوفرة النسبية للرنا المقسم إلى الحمض النووي الريبي غير المرتبط. ن & # x02265 4 أشرطة الخطأ هي SEM. (ب) تمثيل تخطيطي لـ FOS الجين. (خطوط رمادية) موقع أمبليكونات qPCR المستخدمة في ChIP. تم استخدام الأجسام المضادة التالية: & # x003b1-CBP80 ، & # x003b1-Pol II-CTD (4H8) ، & # x003b1-U2AF-65 (MC3) ، & # x003b1-U5-116K ، و & # x003b1-GFP في حالة خطوط الخلايا المعدلة وراثيًا التي تعبر عن U1-70K-GFP أو SF3A1-GFP. تم حساب جميع القيم كنسبة مئوية من المدخلات ، وتم تطبيعها إلى ChIP غير المناعي ، وتم تقديمها كإثراء أضعاف على منطقة بين الجينات. في Pol II ChIP ، تم حذف التطبيع بين الجينات بسبب عدم وجود خلفية. ن & # x02265 3 أشرطة الخطأ هي SEM. اختلافات كبيرة بين الضربة القاضية والتحكم التي يحددها الطالب & # x02019s ر-اختبار: (*) ص & # x0003c 0.05، (**) ص & # x0003c 0.01.

كخطوة أولى ، استخدمنا ChIP لتقدير تأثير CBP80 RNAi على مستويات CBC في FOS وحدة النسخ. أكد CBP80 ChIP أن انخفاض & # x0223c80 ٪ في بروتين CBP80 الخلوي يتوافق مع انخفاض مستويات CBP80 على طول FOS الجين (الشكل 3 ب). لم تتغير مستويات هيستون الأسيتيل H4 (AcH4) و Pol II بسبب استنفاد CBC (الشكل 3 ب الشكل التكميلي 4 ب) ، مما يشير إلى ذلك FOS النسخ لا يعتمد على CBC. بعد ذلك ، قمنا بفحص إزالة intron في الحالة المستقرة في FOS RNA بواسطة RT-qPCR ، مما كشف أن مستويات غير مقسمة FOS زادت الإنترونات 1 و 3 بمقدار ضعفين عند ضربة قاضية لـ CBC (الشكل 3 أ). في موازاة ذلك ، انخفاض في المجموع FOS وقد لوحظ مرنا (الشكل التكميلي 4 أ). مستويات مرنا آخر قصير العمر تقسم ، MYC، تم أيضًا تقليله بشكل كبير ، وتم منع تضفير الإنترون الأول بنسبة & # x0223c30 ٪ (البيانات غير معروضة). في نفس الوقت ، mRNAs ذات نصف عمر طويل ، مثل ACTB، لم يتأثر باستنفاد CBC (الشكل التكميلي 4 أ) ، مما يشير إلى أن استنفاد CBC يثبط ولكنه لا يلغي نشاط الربط. مؤشر آخر على نشاط الربط الخلوي هو الشكل المورفولوجي: البقع النووية عادة ما تكون مترابطة وغير منتظمة الشكل حيث تتركز عوامل الربط. عند تثبيط الربط باستخدام spliceostatin A ، تصبح البقع & # x0201crounded & # x0201d (Kaida et al. 2007). يوضح الشكل التكميلي 5 أن البقع النووية عرضت أيضًا شكلًا مستديرًا عند استنفاد الخلايا من CBC ، بما يتوافق مع تثبيط التضفير الكلي المتوقع (انظر المقدمة). لتحديد تأثير استنفاد CBC على التضفير التكراري ، الوليدة FOS تم استرجاع الحمض النووي الريبي عن طريق الترسيب المناعي للكروماتين RNA (ChRIP) ، حيث يتم ترسيب الكروماتين النشط المتقاطع مع الأجسام المضادة لـ AcH4 (Listerman et al.2006). يوضح الشكل 3 أ أن التضفير النسخي لـ FOS تم إعاقة الإنترونات 1 و 3 عند استنفاد CBC ، على غرار التضفير الكلي قبل الرنا المرسال. تشير هذه النتيجة إلى أن تثبيط التضفير ليس من المحتمل أن يكون بسبب التأثيرات على النشاط المعقد التالي ، لأنه لا يُتوقع أن يزعزع NEXT استقرار الحمض النووي الريبي الناشئ. نستنتج أن غياب CBC يؤدي إلى انخفاض كفاءة إزالة intron cotranscriptional.

يؤدي استنفاد CBC إلى إعاقة تجميع اللصاق النسبي

مع العلم أن CBC مطلوب للنشأة الفعالة FOS ربط الحمض النووي الريبي ، سعينا إلى تحديد الخطوة التي يتم فيها تغيير تجميع لصق الجسيمات في غياب CBC. لذلك قمنا بالتحقيق في ملفات تعريف التوظيف الخاصة بـ snRNPs ، باستخدام مقايسة تجميع spliceosome النسخية بناءً على ChIP (Gornemann et al. 2005 Listerman et al. 2006 Sapra et al. 2009). تم استخدام البروتينات الخاصة بـ SnRNP كوكلاء لكل snRNP: U1 (U1-70K) و U2 (SF3A1) و U4 / U6 & # x000b7U5 (U5-116K). تم دمج بروتينات snRNP الموسومة بـ GFP والتي تم التعبير عنها بثبات من BACs في snRNPs وتم ترجمتها بشكل صحيح (الشكل التكميلي 1A & # x02013C).

The levels and profiles of the U1, U2, and U4/U6·U5 snRNPs as well as U2AF65 were determined at four positions within exons and introns along the length of FOS ( Fig. 3 B). Upon CBC knockdown, accumulation of all three snRNPs was decreased ( Fig. 3 B). These effects are specific, because U2AF65 accumulation was unaffected. U5-116K accumulation was reduced significantly at the beginning as well as the end of FOS ( Fig. 3 B). The decrease in U4/U6·U5 snRNP recruitment is consistent with the notion that CBC associates with protein components of the tri-snRNP, namely, U5-200K, U4/U6-60K, and U4/U6-61K (see Fig. 1 Table 1 ) to assist spliceosome assembly. CBC depletion also caused marked reductions in U1 and U2 snRNP recruitment with accumulation of U1-70K-GFP 50% reduced at all positions ( Fig. 3 B). Because our results point to CBC interactions with U4/U6·U5 and not U1 snRNP proteins ( Fig. 1 Table 1 ), these data suggest that U4/U6·U5 snRNP association with CBC could assist U1 snRNP recruitment. Prior studies reported U5 snRNP interactions with the 5′ ss early in spliceosome assembly as well as U1 snRNP recruitment in the context of a multi-snRNP-containing complex (Wyatt et al. 1992 Malca et al. 2003). Thus, our data support the notion that CBC helps recruit U1 snRNP to the first 5′ ss (Lewis et al. 1996b), not by direct interactions with U1 but instead indirectly through the U4/U6·U5 snRNP. Moreover, the U1 snRNP is retained on multiple intron-containing pre-mRNAs after the first splicing event, rendering subsequent splicing more efficient (Crabb et al. 2010). Indeed, splicing of both FOS introns 1 and 3 was CBC dependent, suggesting—together with the observed snRNP profiles—that CBC may help retain the U1 snRNP on nascent RNA until all introns are removed. We conclude that proper cotranscriptional accumulation of U1, U2, and U4/U6·U5 snRNPs is dependent on CBC in vivo.

CBC promotes U1 and U5 snRNP interactions with pre-mRNA

The above data suggest that CBC’s overall role in FOS splicing is to enhance spliceosomal snRNP interactions with nascent RNA through its association with U4/U6·U5 snRNPs. To test this proposal more broadly, we used a live-cell imaging strategy to analyze the dynamic interaction of snRNPs with pre-mRNA both globally and at a different test gene. We addressed total cellular pre-mRNA by monitoring snRNP dynamics in the nucleoplasm complementary to this, we used an integrated, inducible transcription unit (E3) containing three exons and two introns of the β-globin gene ( Fig. 4 A Huranova et al. 2010 Pabis et al. 2010 Brody et al. 2011). E3 mRNA contains the MS2 binding site in the 3′ UTR, such that active transcription sites can be monitored in living cells with a fluorescently tagged MS2-binding protein. BACs harboring U1-70K-GFP, U2AF65-GFP, and Prp8-GFP were stably integrated into E3 cells, and fluorescence imaging revealed that U2AF65, U1, and U5 snRNPs were detectable in speckles and nucleoplasm, as expected ( Fig. 4 B). Importantly, each of these splicing factors accumulated at the E3 gene during active transcription, as seen by colocalization with E3 nascent RNAs at the transcription site ( Fig. 4 B).

CBC depletion reduces snRNP interactions with active transcription sites. (أ) Diagram of the E3 construct stably integrated into U2OS cells. Expression is driven by a minimal CMV promoter (P) under control of the tetracycline response element and induced in the presence of doxycycline (dox) by the transactivator rtTA. The gene contains three β-globin exons (E1�) and a CFP coding sequence, 18 MS2 repeats, a polyadenylation cleavage signal, and a transcription terminator (T). (ب) Imaging of nascent RNA at the E3 transcription unit in fixed cells by RNA FISH (Cy3-labeled probe to the MS2 sequence repeats red) together with the stably integrated U1 snRNP (U1-70K-GFP green), U2AF65-GFP, or U5 snRNP proteins (Prp8-GFP). Scale bars, 5 μm. (ج) FRAP curves show recovery of U1-70K-GFP, U2AF65-GFP, and Prp8-GFP fluorescence at bleached spots placed in nucleoplasm, speckles, or at the E3 transcription site visualized by MS2BP-mCherry. Three independent experiments were performed in each 10� cells were tested. Error bars represent the SEM. For U1-70K-GFP and Prp8-GFP, the differences between recovery curves in control and CBC knockdown cells are statistically significant, as established using the Mann–Whitney test.

FRAP experiments revealed CBC-dependent dynamics among U1 and U4/U6·U5 snRNPs at both the E3 transcription site and in the nucleoplasm, where endogenous splicing occurs ( Fig. 4 C). In both locations, significantly faster recovery of both U1 and U5 snRNPs was observed upon CBC depletion, indicating that each snRNP was retained at sites of transcription for a shorter period of time. In contrast, mobility of U1 and U5 snRNPs in nuclear speckles was unchanged, suggesting that snRNP accumulation in speckles does not depend on interactions with CBC. No effects on U2AF65 recovery or mobility were observed at any location ( Fig. 4 C), in agreement with the ChIP data ( Fig. 3 B). Because the mobility of nucleoplasmic snRNPs is determined by association with pre-mRNA (Huranova et al. 2010), these data indicate that CBC knockdown weakens U1 and U4/U6·U5 snRNP interactions with endogenous pre-mRNAs in living cells. This finding is consistent with morphological evidence that splicing is globally inhibited (Supplemental Fig. 5).


Splicing Occurs at Short, Conserved Sequences in Pre-mRNAs via Two Transesterification Reactions

During the final step in formation of a mature, functional mRNA, the introns are removed and exons are spliced together (see Figure 11-7). The discovery that introns are removed during splicing came from electron microscopy of RNA-DNA hybrids between adenovirus DNA and the mRNA encoding hexon, a major virion capsid protein (Figure 11-13). * Similar analyses of hybrids between RNA isolated from the nuclei of infected cells and viral DNA revealed RNAs that were colinear with the viral DNA (primary transcripts) and RNAs with one or two of the introns removed (processing intermediates). These results, together with the findings that the 59 cap and 39 poly(A) tail of mRNA precursors are retained in mature cytoplasmic mRNAs, led to the realization that introns are removed from primary transcripts as exons are spliced together. For short transcription units, RNA splicing usually follows cleavage and polyadenylation of the 3′ end of the primary transcript. But for long transcription units containing multiple exons, splicing of exons in the nascent RNA usually begins before transcription of the gene is complete.

Figure 11-13

Demonstration that introns are spliced out by electron microscopy of RNA-DNA hybrid between adenovirus DNA and the mRNA encoding hexon, a major viral protein. (a) Diagram of the EcoRI A fragment of adenovirus DNA, which extends from the left end of the (more. )

The location of exon-intron junctions (i.e., splice sites) in a pre-mRNA can be determined by comparing the sequence of genomic DNA with that of the cDNA prepared from the corresponding mRNA. Sequences that are present in the genomic DNA but absent from the cDNA represent introns and indicate the positions of splice sites. Such analysis of a large number of different mRNAs revealed moderately conserved, short consensus sequences at intron-exon boundaries in eukaryotic pre-mRNAs in higher organisms, a pyrimidine-rich region just upstream of the 3′ splice site also is common (Figure 11-14). The most conserved nucleotides are the (5′)GU and (3′)AG found at the ends of most introns. Deletion analyses of the center portion of introns in various pre-mRNAs have shown that generally only 30 –� nucleotides at each end of an intron are necessary for splicing to occur at normal rates.

Figure 11-14

Consensus sequences around 5′ and 3′ splice sites in vertebrate pre-mRNAs. The only nearly invariant bases are the (5′)GU and (3′)AG of the intron, although the flanking bases indicated are found at frequencies higher than (more. )

Recombinant DNAs containing the 5′ splice site of one transcription unit (e.g., SV40 late region) and the 3′ splice site of another (e.g., mouse β-globin gene) have been prepared and introduced into cultured cells. Spliced mRNA molecules are formed in which the two exon sequences are joined and the chimeric intron is deleted precisely. The formation of correctly spliced mRNAs in such experiments indicates that the cell’s splicing machinery can recognize 5′ and 3′ splice sites and correctly splice them together, with little influence from the intervening sequence in most cases.

Analysis of the intermediates formed during splicing of pre-mRNAs in vitro led to the conclusion that introns are removed as a lariat structure in which the 5′ G of the intron is joined in an unusual 2′,5′-phosphodiester bond to an adenosine near the 3′ end of the intron (Figure 11-15). This A residue is called the branch point because it forms an RNA branch in the lariat structure.

Figure 11-15

Analysis of RNA products formed in an in vitro splicing reaction. A nuclear extract from HeLa cells was incubated with a 497-nucleotide radiolabeled RNA (قاع) that contained portions of two exons (orange and tan) from human β-globin mRNA separated (more. )

The finding that excised introns have a branched lariat structure led to the discovery that splicing of exons proceeds via two sequential transesterification reactions (Figure 11-16). In each reaction, one phosphate-ester bond is exchanged for another. Since the number of phosphate-ester bonds in the molecule is not changed in either reaction, no energy is consumed. The net result of these two transesterification reactions is that two exons are ligated and the intervening intron is released as a branched lariat structure.

Figure 11-16

Splicing of exons in pre-mRNA occurs via two transesterification reactions. In the first reaction, the ester bond between the 5′ phosphorus of the intron and the 3′ oxygen (red) of exon 1 is exchanged for an ester bond with the 2′ (more. )


المقدمة

Pre-mRNA splicing is a two-step transesterification reaction catalyzed by the spliceosome, a large complex assembled from preformed subcomplexes, called spliceosomal small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) and hundreds of additional proteins (Jurica and Moore, 2003). In turn, the five major spliceosomal snRNPs, U1, U2, U4, U5, and U6, each consist of a single small nuclear RNA (snRNA) and specific set of proteins. Among the shared protein components of snRNPs are the seven Sm proteins, which are assembled as a stable, heteroheptameric ring on the RNA polymerase II-transcribed snRNAs: U1, U2, U4, and U5. After transcription, these snRNAs are transported to the cytoplasm, where the Sm ring is assembled on snRNAs by the SMN complex. Subsequently, the 5′ ends of the snRNAs are hypermethylated to generate the trimethyl-guanosine cap, which together with SMN, promotes snRNP nuclear import (reviewed in Will and Luhrmann, 2001 Matera and Shpargel, 2006 Tycowski وآخرون.، 2006). Because snRNPs do not shuttle between the nucleus and cytoplasm (Änkö and Neugebauer, unpublished data), Sm ring assembly seems to occur early and only once in the lifetime of each snRNP. A related heteroheptameric ring, consisting of seven “like-Sm” (LSm) proteins, is assembled on U6, an RNA polymerase III transcript, which is thought to remain in the nucleus for all assembly steps (Achsel وآخرون., 1999 Mayes وآخرون., 1999 Kiss, 2004 Listerman وآخرون., 2007).

Once back in the cell nucleus, snRNPs first accumulate in CBs before distributing throughout the nucleoplasm, where splicing occurs (Sleeman and Lamond, 1999 Sleeman وآخرون., 2001 Neugebauer, 2002). This suggests a role for CBs in nuclear steps of snRNP maturation, a prediction borne out by the following set of observations. First, posttranscriptional modifications of the snRNAs themselves occur in CBs after snRNP reimport from the cytoplasm (Darzacq وآخرون., 2002 Kiss, 2002 Jady وآخرون.، 2003). These modifications, including pseudouridinylation and 2′-ا-methylation, are guided by small Cajal body-specific RNAs. Second, CBs are the site of complex assembly steps that involve RNA–RNA annealing and the sequential addition of proteins. For example, the U4/U6 snRNP is formed when the U4 and U6 snRNAs anneal, a step catalyzed by U6-specific LSm proteins and SART3 (also named hPrp24 or p110) (Ghetti وآخرون., 1995 Raghunathan and Guthrie, 1998 Achsel وآخرون., 1999 Bell وآخرون.، 2002). Subsequently, the U4/U6·U5 tri-snRNP assembles when U5 snRNP associates by protein–protein interactions with the U4/U6 snRNP (Makarova وآخرون., 2002 Schaffert وآخرون.، 2004). Both U4/U6 and U4/U6·U5 tri-snRNP assembly occur in CBs (Schaffert وآخرون., 2004 Stanek and Neugebauer, 2004). Recently, mathematical modeling of U4/U6 snRNP formation in the cell nucleus revealed that accumulation of U4 and U6 snRNPs in CBs should greatly increase the efficiency of U4/U6 assembly (Klingauf وآخرون.، 2006). An additional role of CBs in U2 snRNP formation (Nesic وآخرون., 2004) further points to CBs as the key site of nuclear steps in snRNP assembly. The observation that depletion of coilin, a protein required for snRNP concentration in CBs, impairs cell proliferation (Lemm وآخرون., 2006) is consistent with the proposal that snRNP assembly is inefficient in the absence of CBs.

snRNPs must not only assemble de novo but also may regenerate after splicing to complete the so-called spliceosome cycle. During spliceosome assembly and activation, snRNPs undergo structural rearrangements, including U4/U6 snRNA unwinding and release of the U4 snRNP from the spliceosome (Staley and Guthrie, 1998). After splicing, mRNA is released from the spliceosome by the DEAH-box helicase hPrp22/HRH1 and snRNPs remain associated with the excised intron lariat (Company وآخرون., 1991 Ohno and Shimura, 1996). في خميرة الخميرة, a complex of three proteins (Prp43/Ntr1/Ntr2) was shown to be essential for release of individual snRNPs from the lariat (Arenas and Abelson, 1997 Martin وآخرون., 2002 Tsai وآخرون., 2005 Boon وآخرون., 2006 Tanaka وآخرون., 2007 Tsai وآخرون.، 2007). If these released snRNPs are to participate in subsequent rounds of splicing, they have to be reassembled into the active U4/U6·U5 tri-snRNP. Several studies provide genetic and biochemical evidence for snRNP reassembly (Raghunathan and Guthrie, 1998 Bell وآخرون., 2002 Verdone وآخرون., 2004 Chen وآخرون.، 2006). Although snRNPs are highly expressed, the long half-lives of snRNAs suggests that they likely recycle and function again (Yu وآخرون., 1999).

In the present study, we address the hypothesis that snRNPs cycle more than once through CBs. We show in living cells that CBs contain mostly mature snRNPs, which are capable of exchanging with nucleoplasm and visiting multiple CBs. Targeted knockdown of proteins involved in spliceosome recycling, hPrp22, and the human homologue of the recently identified yeast Ntr1, led to a dramatic accumulation of the U4/U6 snRNP in CBs. These data demonstrate that the CB is a vital way station in the spliceosomal cycle.


المواد والأساليب

Yeast strain construction

Gene disruption and tagging on the chromosome were performed using PCR fragments following a published strategy ( Puig وآخرون, 1998 ) SNU17, BUD13 و PML1 genes were disrupted with the S. بومبي HIS3 marker from pFA-HIS3MX6 ( Wach وآخرون, 1997 ) in the haploid strain BMA64-1a (MATa, ura3-1, trp1- 2, leu2-3,112, his3-11, ade2-1, can1-101). RDS3 و YSF3 genes were disrupted by integrating K. tactis TRP1 marker from pBS1479 in the diploid strain BSY320 (ade2, arg4, leu2-3 112, trp1-289, ura3-52).

Ysf3 TAP, Snu17 TAP, Bud13 TAP and Pml1 TAP strains were constructed as described previously ( Rigaut وآخرون، 1999). The TAP Rse1 fusion strain was described previously ( Puig وآخرون, 2001 ).The Δmlp1 strain was described ( Galy وآخرون, 2004 ).

TAP purification

All TAP purifications were performed as described previously from 2 l of culture ( Rigaut وآخرون، 1999). Purified proteins were concentrated by lyophilization, separated by SDS–PAGE and stained with Coomassie Blue or silver.

Mass spectrometry analysis

Proteins were identified following ‘in gel’ digestion ( Pandey and Mann, 2000 Godovac-Zimmermann and Brown, 2001 Rappsilber and Mann, 2002 ). Coomassie-stained gels were treated directly, while silver-stained bands were rapidly destained using the Silver Quest decoloration kit (Sigma Aldrich). Digestion was carried out overnight with the addition of 50 ng of trypsin. A MALDI-Tof mass spectrometer (Voyager DE STR, Applied Biosystem) fitted with a pulsed nitrogen laser (337 nm) was used. Mass spectra were acquired in the reflectron mode. The total acceleration voltage was 20 kV, with a grid voltage of 68% and a delay extraction of 240 ns. Close external calibration was realized using a standard peptide mix solution ranging from 573 to 3496 Da (LaserBio Labs, SophiaAntipolis). Samples were prepared in the CHCA matrix at a final concentration of 10 mg/ml in acetonitrile/trifluoroacetic acid (70/0.1%) solution. In all, 1 μl of this sample solution corresponding to a dilution of 1:2 was then deposited on the MALDI target and dried.

Database scans were performed by using MS Fit and Profound search engines. Protein identifications were obtained with a sequence coverage of 55–86% in average, and mass accuracies of about 15–60 ppm.

في المختبر splicing analysis

Splicing reactions were as described before, except that the incubation was performed for 30 min at 25°C ( Séraphin وآخرون, 1988 ). Pre-mRNA was generated by في المختبر transcription of plasmid pBS195 (wild type) or pBS199 (ΔUACUAAC) digested with DdeI. Reactions were stopped by addition of 200 μl of PK buffer (0.1 M Tris–HCl (pH 7.5), 12.5 mM EDTA (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% SDS) containing 80 μg of proteinase K (Sigma) and 10 μg of الإشريكية القولونية tRNA. After incubation for 20 min at 37°C, RNA was extracted and analysed in a 15% polyacrylamide–7 M urea gel.

For complementation of في المختبر splicing reaction with purified RES complex, it was TAP purified and dialysed against buffer D (20 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 150 mM KCl, 8% glycerol, 0.5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride and 0.5 mM dithiothreitol. A volume of 1 μl of purified material (or as control buffer D) was added to 10 μl splicing reactions.

Immunoprecipitation and primer extension

Immunoprecipitation and primer extension were as described previously ( Séraphin, 1995 ). Immunoprecipitation of pre-mRNA was performed similarly: Briefly, 50 μl splicing reactions were preformed. In all, 10 μl of the reaction was extracted and kept as an input, while the remaining 40 μl was diluted in 500 μl of IPP150 buffer (10 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 0.1% NP40) and used for immunoprecipitation.

في الجسم الحي splicing assays

Δsnu17، Δbud13، Δpml1 strains and an isogenic control were transformed with reporters: RP51A wild-type intron (HZ18), 5′II (HZ12) ( Jacquier وآخرون, 1985 ), pre-mRNA in-frame (pLG-Nde°Acc°), mRNA in-frame or no intron (pLG-SD5) ( Jacquier وآخرون, 1985 Rain and Legrain, 1997 ). Reporters were assayed for β-galactosidase activity at two temperatures, 25 and 37°C. Strains were grown overnight at 25°C in a synthetic medium without uracil containing 2% lactate (pH 5.5), 2% glycerol and 0.05% glucose to an OD600 of 0.5–0.8. Cultures were maintained at 25°C or shifted to 37°C for 1 h before a 2 h induction of β-galactosidase. β-Galactosidase activity was tested as described previously ( Rutz and Séraphin, 2000 ). All the experiments were performed in duplicate using two independent transformants. Error bars present standard deviation. Primer extensions to analyse splicing and retention reporters were performed as described previously ( Jacquier وآخرون, 1985 ).

Biocomputing

BLAST was used for database searches. Multiple sequence alignments were done with ClustalW. The neighbour-joining tree was computed, excluding positions with gaps and correcting for multiple substitutions using Clustal W ( Thompson وآخرون, 1994 ).


شاهد الفيديو: How Spliceosomes Process RNA. (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Murphy

    موافق ، عبارة مفيدة جدا

  2. Elvy

    انت مخطئ. أنا متأكد. نحن بحاجة إلى مناقشة. اكتب لي في PM.

  3. Vir

    برافو ، عبورك مفيدة

  4. Kyrkwode

    تحدث مباشرة.

  5. Kameron

    أنا مندهش من براعة وخيال المؤلف المحترم!

  6. Sheffield

    السؤال مثير للاهتمام ، أنا أيضًا سأشارك في المناقشة.

  7. Gard

    بالطبع ، أعتذر ، لكن هذه الإجابة لا تناسبني. ربما هناك المزيد من الخيارات؟



اكتب رسالة