معلومة

3.7: فحص سلوك البروتين - علم الأحياء

3.7: فحص سلوك البروتين - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

مقدمة

ستحصل اليوم على منحنيات معايرة مقابل الكالسيوم لبروتيناتك البرية والمتحولة باستخدام قارئ لوحة التألق الآلي. الإخراج عبارة عن شبكة تصل إلى 96 قيمة مضان ، للصفوف A-G والأعمدة 1-12 ، وهي قابلة للتحليل باستخدام برنامج مثل Excel.

من أجل الاستفادة بشكل أكبر من تنسيق الاختبار عالي الإنتاجية هذا ، ستقوم بتكوين صداقات مع الماصة متعددة القنوات ، وهي أداة ميكانيكية بحتة وليست رقمية للتجارب المتكررة. تتيح لك هذه الأداة شفط وطرد كميات متكافئة من عدة عينات متطابقة (عادةً 8-12 في كل مرة) بضربة واحدة فقط. ستستخدم هذا النوع من الماصات لملء كل صف من صفيحة ميكروتيتر بنوع واحد من عينة البروتين ، وكل عمود بتركيز مختلف من الكالسيوم. على الرغم من أن الماصة متعددة القنوات يمكن أن تكون كافية لمختبر أبحاث نموذجي ، إلا أنه في شركات الأدوية التي قد تقوم بفحص آلاف العينات يوميًا ، إلا أنه يلزم المزيد من خطوات الأتمتة والتوسيع ، مثل أذرع الماصات الآلية التي تغني عن الحاجة إلى سحب العينات يدويًا في الكل. درجة الأتمتة المتاحة تجارياً ، أو المطورة "داخلياً" في معمل أو شركة معينة ، تعتمد جزئياً على تكرار استخدام مقايسة معينة. من المحتمل أن تولد المقايسات المستخدمة من قبل العديد من المعامل والشركات المختلفة (مثل القياس الطيفي للامتصاص أو التألق) آلات عالية الإنتاجية متوفرة تجاريًا.

في حين أن مفهوم المقياس هو مصدر قلق عملي ، ربما يكون الموضوع الأكثر موضوعية الذي يثير اهتمامنا اليوم هو الثقة في نتائجنا. ربما تكون على دراية جيدة ، فكل معالجة وقياس تقوم بهما في المختبر له خطأ مرتبط به. على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك ماصة P200 في كل مكان. وفقًا لإحدى شركات تصنيع الماصات ، تبلغ دقتها 1٪ (أسوأ قليلاً عند أدنى الأحجام). لذا فإن محاولة ماصة 100 ميكرولتر ستؤدي إلى حجم فعلي قدره 99-101 ميكرولتر من خطأ الجهاز وحده ، والذي يمكن أن يتضاعف أكثر بواسطة عامل ماصة نعسان ، على سبيل المثال. عادةً ما تكون دقة الماصة أفضل من دقتها ، 0.25٪ للمثال المذكور أعلاه. تشير الدقة إلى إمكانية استنساخ قياس معين ، وليس دقتها المطلقة. يوضح هذا المثال البسيط المبادئ العامة المطبقة على أنواع الخطأ الأخرى.

ستحاول التعرف على الخطأ العام لتجربة اليوم عن طريق تشغيل عينات البروتين الخاصة بك في نسختين. أي ، لكل تركيبة من البروتين والكالسيوم ، ستجري قياسين مستقلين. يمكن بعد ذلك حساب متوسط ​​هذه القياسات لتنعيم بياناتك ، ونأمل أن يتم تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء - حيث تشير الإشارة هنا إلى الاختلافات الحقيقية بين العينات الممزوجة بكميات مختلفة من الكالسيوم ، والضوضاء تعني التقلبات المتأصلة في النظام بسبب الخطأ. يمكن أن تشير الضوضاء في هذه التجربة أيضًا إلى تألق خلفية المخزن المؤقت للعينة. وبالتالي ، هناك طريقة أخرى للحفاظ على إشارة معقولة: تتمثل نسبة الضوضاء في الحفاظ على تركيز البروتين إلى حد ما ، بحيث تكون قيم التألق المطلقة التي نحصل عليها عالية مقارنة بالخلفية. يوضح الشكل الموجود على اليمين المفاهيم المذكورة أعلاه. يعد التشتت في البيانات (ليست كل الدوائر على نفس الارتفاع) أحد أنواع الضوضاء. مستوى الخلفية هو نوع آخر من الضوضاء: البيانات اليسرى لها إشارة منخفضة نسبيًا وبالتالي إشارة ضعيفة: نسبة الضوضاء ، بينما البيانات اليمنى لديها إشارة مطلقة عالية نسبيًا وإشارة محسنة: نسبة الضوضاء.

البروتوكولات

فقط 2-3 مجموعات في وقت واحد ستعمل في المختبر اليوم. آخر مرة كان يجب أن تسجل فيها لمدة ساعة واحدة.

الجزء 1: مراقبة جل البروتين

إذا كنت ترغب في ذلك ، فقم بإلقاء نظرة على جل Coomassie الملون الخاص بك من المختبر السابق.

نصائح للنجاح

توخ الحذر الشديد اليوم للحد من إدخال الفقاعات في عيناتك. عند طرد السوائل ، الماصة ببطء أثناء لمس طرف الماصة في قاع البئر أو جانبه. عند استخدام الماصة متعددة القنوات ، تحقق دائمًا للتأكد من أن جميع الأطراف ممتلئة - في بعض الأحيان قد لا يكون طرف واحد على طول الطريق ، وسوف يسحب حجمًا أقل من الأطراف الأخرى. إذا حدث هذا ، حرر السائل واضبط الطرف وحاول مرة أخرى.

بروتوكول

  1. خذ لوحة 96-جيدا سوداء ، وتعرف على المخطط على اليمين: الصفان العلويان من النوع البري ، والصفان التاليان هما متحولة M124S ، والصفان الأخيران هما متحولة الخاص بك.
    • تقلل الجوانب المظلمة من اللوح "الحديث المتقاطع" (أي تسرب الضوء) بين العينات في الآبار المجاورة ، وهي مساهمة محتملة أخرى في حدوث الخطأ.
  2. انقل قسامة من البروتين من النوع البري إلى خزان بلاستيكي. استخدم الماصة متعددة القنوات لإضافة 30 ميكرولتر من البروتين (لكل بئر) إلى الصفين العلويين من اللوحة.
  3. خذ خزانًا جديدًا ، وكرر الخطوة 2 للبروتينات الطافرة ، مع إضافة كل واحد إلى الصفوف المسمى بشكل مناسب.
  4. أخيرًا ، أضف المخزن المؤقت EB العادي (بدون بروتين) إلى الصف السابع من اللوحة ، باستخدام الخزان المخصص المشترك. (لماذا تعتقد أننا نقوم بتضمين صف من الحلول الخالية من البروتين؟)
  5. باستخدام الخزان المشترك 1 (أدنى تركيز للكالسيوم) ، أضف 30 ميكرولتر إلى أعلى سبعة صفوف في العمود الأول من اللوحة. تجاهل نصائح الماصة.
  6. الآن اعمل في طريقك من الخزانات 2 إلى 12 (أعلى تركيز للكالسيوم) ، ومن اليد اليسرى إلى الأعمدة اليمنى على طبقك. تأكد من استخدام رؤوس ماصة جديدة في كل مرة! إذا قمت بتلويث أحد الحلول ، فأخبر أعضاء هيئة التدريس حتى يتمكنوا من وضع بعض الحلول الجديدة.
  7. أخيرًا ، قم بتغطية الطبق ببارافيلم ولفه بورق الألمنيوم.

الجزء 2: فحص الإسفار

  1. وافق BPEC (مركز هندسة العمليات البيولوجية) بكرم على السماح لنا باستخدام قارئ اللوحات الخاص بهم. انتقل إلى غرفة أدوات BPEC مع أحد أعضاء هيئة التدريس.
  2. سيظهر لك كيفية ضبط الإثارة (485 نانومتر) والانبعاث (515 نانومتر) الطول الموجي على قارئ اللوحة لفحص البروتين الخاص بك.
  3. سيتم إرسال بياناتك الأولية أو إرسالها بالبريد الإلكتروني ؛ بدلاً من ذلك ، يمكنك إحضار محرك الأقراص المحمول الخاص بك لاستعادة البيانات على الفور.

في المرة القادمة

  1. قم بإعداد شكل وتعليق لنتائج SDS-PAGE الخاصة بك. ابحث عن الوزن الجزيئي المتوقع باستخدام وثيقة تسلسل IPC وهذا على الإنترنت الوزن الجزيئي للبروتين أداة (أو موقع ويب مشابه). تأكد من إضافة ~ 3 KDa لحجم N-terminus لـ pRSET (علامته ، إلخ). إذا رأيت فرقتين قويتين ، فماذا تعتقد أن الفرقة الثانية هي؟ سيتم تقدير هذا الواجب المنزلي خلال الفصل الدراسي في المرة القادمة حتى تتمكن من دمج أي تعليقات في تقريرك النهائي.

تم استخدام تطبيقات هندسية مختلفة لتوصيل الجزيئات والمركبات في كل من الإعدادات الفطرية والبيولوجية. في سياق التطبيقات البيولوجية ، يمكن أن يكون توصيل الجزيئات في الوقت المناسب أمرًا بالغ الأهمية للوظيفة الخلوية والعضوية. على هذا النحو ، أظهرت الدراسات السابقة تفوق توصيل البروتين على المدى الطويل ، عن طريق ربط البروتين على سقالات مُصنَّعة بالهندسة الحيوية ، مقارنةً بالتوصيل التقليدي للبروتين القابل للذوبان في المختبر و في الجسم الحي. على الرغم من هذه الفوائد ، لا يوجد سوى القليل من المعرفة فيما يتعلق بالاستقرار ، وحركية الإطلاق ، وطول العمر ، وتفعيل المسار داخل الخلايا ، ووظائف هذه البروتينات بمرور الوقت. على سبيل المثال ، قمنا هنا بفحص استقرار وتدهور ووظيفة البروتين ، عامل التغذية العصبية المشتق من الدبقية (GDNF) ، والذي يُعرف بتأثيره على بقاء الخلايا العصبية ، والتمايز ، وتكوين النوريت. كشفت فحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أن GDNF ، المربوط تساهميًا على سقالات ألياف نانوية مغزولة كهربائياً (PCL) ، ظل موجودًا على سطح السقالة لمدة 120 يومًا ، مع عدم وجود دليل على ترشيح البروتين أو تدهوره. ظل بروتين GDNF المربوط وظيفيًا وقادرًا على تنشيط سلاسل إشارات المصب ، كما يتضح من قدرته على فسفرة Erk داخل الخلايا في خط الخلية العصبية. علاوة على ذلك ، عزز تجميد بروتين GDNF بقاء الخلية والتمايز في الثقافة في كل من 3 و 7 أيام ، مما أدى إلى مزيد من التحقق من صحة وظائف البروتين لفترات طويلة ، إلى ما بعد الإطار الزمني من الدقائق إلى الساعات المرصودة للبروتينات القابلة للذوبان في نفس ظروف الثقافة. تقدم هذه الدراسة أدلة مهمة على استقرار وحركية الجزيئات المربوطة وظيفية.

تم دعم هذا البحث بتمويل من مجلس البحوث الأسترالي ، ومؤسسة Bethlehem Griffith Research Foundation ، وصندوق لجنة المعدات الرئيسية بالجامعة الوطنية الأسترالية.

كلا المؤلفين شارك بمساواة بهذا العمل.


خلفية

الحركة مطلوبة لتوطين الطعام والأصحاب ، والهروب من الحيوانات المفترسة ، والدفاع عن الأرض ، والاستجابة للإجهاد ، وبالتالي فهي جزء لا يتجزأ من معظم سلوكيات الحيوانات. في البشر ، يرتبط مرض باركنسون ومرض هنتنغتون واضطرابات النشاط والاكتئاب بقصور في الحركة. وبالتالي ، فإن فهم البنية الجينية للسلوك الحركي مهم من المنظورين المزدوجين للبيولوجيا التطورية وصحة الإنسان.

يعتبر التحرك سلوكًا معقدًا ، حيث يُعزى الاختلاف في الطبيعة إلى العديد من مواقع السمات الكمية المتفاعلة (QTL) ذات التأثيرات الصغيرة الفردية ، والتي يكون تعبيرها حساسًا للبيئة [1]. يتم تسهيل تشريح البنية الجينية للسلوك المعقد بشكل كبير في الكائنات الحية النموذجية ، مثل ذبابة الفاكهة سوداء البطن، حيث يمكن للمرء تقييم آثار الطفرات لاستنتاج الجينات المطلوبة لإظهار السلوك ، ورسم خريطة QTL التي تؤثر على التباين الذي يحدث بشكل طبيعي بدقة عالية [2]. من المرجح أن يتم تلخيص السمات العامة للهندسة الجينية للسلوكيات المعقدة عبر الأصناف المتنوعة. يتم حفظ العمليات البيولوجية الأساسية ، بما في ذلك تطور الجهاز العصبي ، تطوريًا بين الذباب والثدييات [3]. وهكذا ، تؤثر الجينات على تقويم تقويم العظام ذبابة الفاكهة قد تكون الحركة ذات صلة بالبشر. على سبيل المثال ، يرتبط مرض باركنسون بالتنكس التدريجي للخلايا العصبية الدوبامينية للولادة [4 ، 5] ، كما أن الدوبامين متورط في حركة الفئران [6] و ذبابة الفاكهة [1, 7–12].

تكشف العديد من الدراسات التعقيد الجيني الأساسي للسلوك الحركي في ذبابة الفاكهة. تؤثر الناقلات العصبية السيروتونين (5-هيدروكسيتريبتامين) [13] ، والأوكتوبامين (المتماثل اللافقاري للنورادرينالين) [14] ، وحمض بيتا أمينوبوتيريك [15] ذبابة الفاكهة الحركة كما هو الحال بالنسبة للجينات المطلوبة للتطور التشريحي العصبي السليم لأجسام عيش الغراب ومكونات المعقد المركزي ، مناطق الدماغ المطلوبة للحركة الطبيعية [16-21]. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتطوير مقايسة عالية الإنتاجية لتحديد عنصر `` التفاعل الحركي '' للسلوك الحركي (يقاس بمستوى النشاط فور حدوث اضطراب ميكانيكي) ، واستخدمنا هذا لرسم خريطة لفصل QTL بين خطين داخليين كان لهما مستويات مختلفة بشكل كبير من التفاعل الحركي [1]. حددنا 13 جينًا مرشحًا موضعيًا يتوافق مع QTL. من المعروف أن ثلاثة من هذه الجينات تؤثر على حركة البالغين ، ستة لها أنماط ظاهرية متحولة تتفق مع المشاركة في تنظيم الحركة ، على الرغم من أن التأثيرات على السلوك الحركي لم يتم قياسها مسبقًا والجينات الأربعة المتبقية ، جميعها ترميز عوامل نسخ بوليميريز RNA II المتورطة في تطور الجهاز العصبي ، كانت الجينات المرشحة الجديدة التي تؤثر على السلوك الحركي. تسلط هذه الدراسة الضوء على قوة استخدام المتغيرات الأليلية الطبيعية لدراسة السلوك المعقد [22] ، ولكنها اقتصرت على تحديد الجينات المنفصلة في الخطين الأبويين المستخدمين ، والتي تمثل عينة محدودة من الأليلات التي تفصل بين السكان الطبيعيين.

تتمثل الإستراتيجية البديلة لاكتشاف الجينات التي تؤثر على السلوكيات المعقدة في الجمع بين الانتقاء الاصطناعي للأنماط الظاهرية المتباينة مع التنميط الكامل للتعبير الجيني [23-28]. الأساس المنطقي لهذا النهج هو أن الجينات التي تظهر تغييرات متسقة في التعبير كاستجابة مرتبطة بالاختيار هي جينات مرشحة تؤثر على السمة المختارة. تتمتع هذه الإستراتيجية بميزتين مقارنة بنماذج رسم خرائط QTL التقليدية والشاشات غير المنحازة للطفرات التي تؤثر على السمات السلوكية. أولاً ، يضمن بدء الاختيار الاصطناعي من مجموعة أساسية كبيرة مشتقة مؤخرًا من الطبيعة تضمين عينة أكبر وأكثر تمثيلاً من الأليلات التي تؤثر على اختلاف التباين في السلوك مقارنة بدراسات رسم خرائط QTL التي تستخدم سطرين أبويين. ثانيًا ، يعتبر تقييم التأثيرات السلوكية للطفرات في الجينات المرشحة التي يتم تنظيم تعبيرها بشكل مشترك في الخطوط المتباينة وراثيًا أكثر كفاءة من الفحص الطفري غير المتحيز لتحديد الجينات التي تؤثر على السمة محل الاهتمام [23 ، 26 ، 27]. هنا ، قمنا بدمج هذه الاستراتيجية مع التحليل الجيني الكمي الكلاسيكي لفهم البنية الجينية للتفاعل الحركي بشكل أكبر. أنشأنا خطوط اختيار اصطناعية من خلفية غير متجانسة وراثيًا واخترناها لمدة 25 جيلًا لاشتقاق خطوط مكررة مع زيادة وانخفاض مستويات التفاعل الحركي ، بالإضافة إلى خطوط التحكم غير المنتقاة. قمنا أيضًا بقياس التفاعل الحركي في مجموعة من 340 سلالة فطرية مشتقة من نفس المجموعة الطبيعية. استخدمنا بعد ذلك تنميط تعبير الجينوم الكامل لتحديد مجموعة الجينات التي تم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين خطوط الاختيار. حددت الاختبارات الوظيفية للطفرات في عشرة من الجينات المعبر عنها تفاضليًا سبعة جينات مرشحة جديدة تؤثر على السلوك الحركي.


نتائج

SERBP1 هي علامة تنبؤية جديدة في GBM

قمنا بتقييم دور SERBP1 كعامل مسرطنة في الورم الدبقي / GBM وتأثيره المحتمل على بقاء المريض والاستجابة للعلاج. في تحليل نسبي متعدد الأنسجة تم إجراؤه باستخدام مجموعة بيانات GTEx [21] ، أظهرت أنسجة المخ انخفاضًا في تعبير SERBP1 mRNA بينما أظهر خطان من الخلايا المتحولة (LCL و FIBRBLS) أعلى المستويات (الشكل 1 أ). بشكل ملحوظ ، يُظهر SERBP1 تعبيرًا أعلى في GBM (عينات TCGA) مقارنة بالدماغ الطبيعي و LGG (ورم دبقي منخفض الدرجة ، الدرجة الثانية) (الشكل 1 ب ، ج ، ملف إضافي 2: الجدول S1). ارتبط تعبير SERBP1 المرتفع بضعف بقاء مرضى الورم الدبقي في مجموعات TCGA و CGGA (الشكل S1A ، الملف الإضافي 3: الجدول S2). علاوة على ذلك ، لاحظنا أن SERBP1 يعرض مستويات متزايدة من التعبير في 25 نوعًا من الأورام مقارنةً بالأنسجة الطبيعية (الملف الإضافي 1: الشكل S1B) وتشير البيانات الموجودة في قاعدة بيانات R2 إلى أن تعبير SERBP1 المرتفع مرتبط بسوء التشخيص في حالات الورم الأرومي العصبي. ، سرطان الغدة البنكرياس ، سرطان المثانة البولية ، سرطان الخلايا الحرشفية العنقية ، والساركوما (ملف إضافي 1: الشكل S1C).

تعبير SERBP1 وتأثيره على بقاء الورم الدبقي والعلاج. أ تعبير SERBP1 mRNA في الأنسجة البشرية الطبيعية بناءً على قاعدة بيانات GTEx. ب تحليل مقارن لتعبير SERBP1 mRNA في عينات الدماغ / القشرة الطبيعية (GTEx) وعينات الورم الدبقي (الصفوف الثاني والثالث والرابع) من اتحاد TCGA. ج المناعة المناعية لعينات الورم الدبقي التمثيلية (الصفوف الثاني والثالث والرابع) من مجموعة مستشفى شنغهاي تظهر مستويات التعبير عن بروتين SERBP1. د تشير منحنيات كابلان-ماير إلى بقاء 177 مريضًا من الورم الدبقي على قيد الحياة من مجموعة مستشفى شنغهاي تشانغتشينغ الذين أظهروا مستويات منخفضة وعالية من SERBP1. هز تشير منحنيات Kaplan-Meier إلى بقاء 118 مريضًا من GBM من مجموعة مستشفى Shanghai Changzheng التي تعرض مستويات منخفضة وعالية من SERBP1: E (جميع المرضى) ، F (54 مريضًا تلقوا TMZ) ، و G (83 مريضًا تلقوا الإشعاع)

لتأكيد هذه النتائج وتوسيعها ، أجرينا دراسة باستخدام مجموعة من الورم الدبقي من مستشفى شنغهاي تشانغتشينغ. تم تحليل العينات عن طريق التلوين المناعي ، ولم يتم الكشف عن SERBP1 في 21.5٪ من العينات ، وكانت إيجابية بشكل طفيف في 18.1٪ ، وكانت إيجابية بشكل معتدل في 37.3٪ ، وكانت إيجابية بشدة في 23.2٪ من المرضى. درسنا كذلك ما إذا كان تعبير SERBP1 مرتبطًا بدرجات الورم الدبقي. كان SERBP1 إيجابيًا في 28.6٪ من المصابين بأورام دبقية من الدرجة الأولى ، و 55.6٪ من المصابين بأورام دبقية من الدرجة الثانية ، و 83.3٪ من المصابين بأورام دبقية من الدرجة الثالثة ، و 89.0٪ من المصابين بأورام دبقية من الدرجة الرابعة (ص & lt 0.001). علاوة على ذلك ، 71.2٪ من المرضى الذين يعانون من الدرجة الرابعة (GBM) لديهم تلطيخ إيجابي عالي لـ SERBP1 ، أكثر بكثير من الدرجة الأولى (7.1٪) ، الدرجة الثانية (40.7٪) ، الدرجة الثالثة (61.1٪) الأورام الدبقية (ص & lt 0.001) (الشكل 1 ج ، ملف إضافي 4: الجدول S3). ارتبط تعبير SERBP1 ارتباطًا وثيقًا بدرجة منظمة الصحة العالمية للورم الدبقي (درجة منخفضة مقابل درجة عالية ، اختبار خي مربع ، ص = 0.002) (ملف إضافي 4: جدول S3). على الرغم من التعبير المتغير عن SERBP1 في الأورام الدبقية ، فإن عينات GBM كان لها تعبير أعلى بشكل ملحوظ عن SERBP1 مقارنة بعينات LGG. كان متوسط ​​البقاء على قيد الحياة 13.12 ± 1.12 شهرًا (95٪ فترات ثقة [CI] 10.91-15.33) للمرضى الذين لديهم تعبير SERBP1 مرتفع و 23.73 ± 1.76 (95٪ CI 20.23–27.23) شهرًا للمرضى الذين يعانون من انخفاض تعبير SERBP1 (ص & lt 0.0001) (الشكل 1 د). كان مرضى GBM الذين لديهم تعبير منخفض عن SERBP1 أطول بشكل ملحوظ (17.41 ± 1.93 شهرًا ، 95٪ CI 13.48-21.35) من أولئك الذين لديهم تعبير SERBP1 مرتفع (10.52 ± 0.97 شهرًا ، 95٪ CI 8.59-12.46) (ص = 0.0006) (الشكل 1 هـ).

قمنا أيضًا بفحص ما إذا كان وقت البقاء على قيد الحياة قد تأثر بالعلاج المساعد بعد الجراحة (العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي). كما هو مبين في (الشكل 1f) ، من بين مرضى GBM الذين تلقوا العلاج الكيميائي (temozolomide) ، كان أولئك الذين لديهم مستويات منخفضة من SERBP1 أطول بكثير (20.91 ± 2.52 شهرًا ، 95٪ CI 15.67–26.15) من أولئك الذين لديهم مستويات عالية من SERBP1 (11.11 ± 1.22 شهرًا ، فاصل الثقة 95٪ 8.68–13.55) (ص = 0.0002). وبالمثل ، اكتسب المرضى الذين يعانون من انخفاض مستويات SERBP1 فائدة أكبر من العلاج الإشعاعي من حيث البقاء على قيد الحياة (18.81 ± 2.69 شهرًا ، 95٪ CI 13.09-24.54) من أولئك الذين لديهم مستويات عالية من SERBP1 (9.24 ± 1.15 شهرًا ، 95٪ CI 6.90-11.57) (ص & lt 0.0001) (الشكل 1 ز). يتم سرد جميع بيانات المريض في (ملف إضافي 5: الجدول S4).

يؤثر SERBP1 على الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالسرطان

لقد أجرينا عدة فحوصات لتحديد ما إذا كان التعبير العالي عن SERBP1 مطلوبًا للحفاظ على الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالسرطان. تم إجراء جميع التجارب باستخدام ضربة قاضية لـ siRNA نظرًا لأن محاولات إنتاج خطوط خروج المغلوب SERBP1 باستخدام نهج CRISPR-Cas9 لم تنجح ، مما يشير إلى أن خطوط GBM التي اختبرناها على الأقل غير قادرة على البقاء بدون وظيفة SERBP1.

تسببت ضربة قاضية SERBP1 في إحداث تأثير كبير على قابلية بقاء الخلية U251 و U343 كما تم اكتشافها عبر مقايسة MTS (الشكل 2 أ ، الملف الإضافي 1: الشكل S2A ، S3A) أجرينا أيضًا اختبارًا لتشكيل مستعمرة الخلية ولاحظنا في كلا الخطين انخفاض في SERBP1 قلل التعبير بشكل كبير من قدرة خلية GBM على تكوين مستعمرات (الشكل 2 ب ، ملف إضافي 1: الشكل S3B). وبالمثل ، باستخدام مقايسة غرفة Boyden ، قررنا أن غزو الخلية قد تعرض للخطر عندما تم إسكات SERBP1 (الشكل 2 ج ، الملف الإضافي 1: الشكل S3C). بعد ذلك ، تحققنا مما إذا كانت ضربة قاضية SERBP1 تؤثر على موت الخلايا المبرمج. درسنا انشقاق PARP1 بواسطة لطخة غربية بالإضافة إلى تلطيخ الملحق V باستخدام قياس التدفق الخلوي في كلا السيناريوهين ، لاحظنا زيادة في المنتج في الخلايا المنقولة بواسطة siSERBP1 مقارنة بالتحكم في siRNA (الشكل 2 د ، هـ). وبالمثل ، لاحظنا نشاط كاسباس 3/7 أعلى في خلايا ضربة قاضية SERBP1 مقارنة بالتحكم ، مما يؤكد دور SERBP1 في موت الخلايا المبرمج (الشكل 2f). أخيرًا ، قمنا بتقييم تأثير SERBP1 على بقاء الخلايا الجذعية للورم الدبقي (GSC) وانتشارها. تم استخدام Geltrex للسماح بنمو مزارع GSC كطبقات أحادية. تم تقييم البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار MTS بينما تمت متابعة تكاثر الخلايا بمرور الوقت باستخدام نظام Incucyte. أدت ضربة قاضية SERBP1 إلى خفض معدل البقاء على قيد الحياة وانتشار كل من GSCs المعرضة للجهاز العصبي واللحمة المتوسطة (الشكل 2g ، h ملف إضافي 1: الشكل S2B).

يؤثر SERBP1 على الأنماط الظاهرية المرتبطة بالسرطان ونمو الورم. أ أدت ضربة قاضية لـ SERBP1 في خلايا U251 إلى تقليل الصلاحية (مقايسة MTS). ب SERBP1 يعمل على إسكات تناقص إمكانات الاستنساخ ، كما تم قياسه بواسطة فحوصات تكوين المستعمرة. ج تم استخدام اختبار غرفة Boyden لتقييم تأثير SERBP1 على قيم الغزو لامتصاص الكريستال البنفسجي الذي أظهر أن ضربة قاضية SERBP1 قللت من احتمال الغزو. دF يزيد إسكات SERBP1 من موت الخلايا المبرمج كما يتضح من انشقاق PARP1 (د) ، مرفق تلطيخ (ه) و caspase (F). ز تم اتباع تكاثر GSC عبر الوقت باستخدام نظام Incucyte الآلي. أدى الانخفاض في مستويات SERBP1 إلى إعاقة تكاثر الخلايا. أنا أدت ضربة قاضية لـ SERBP1 في خطوط GSC إلى تقليل الصلاحية (فحوصات MTS). تم تحليل البيانات مع Student’s ر اختبار وتقديمها على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري. تم استخدام تصحيح Bonferroni لإجراء مقارنات متعددة. *ص ≤ 0.05 **ص ≤ 0.01 ***ص ≤ 0.001 ****ص ≤ 0.0001. أنا تم إنشاء xenografts داخل الجمجمة باستخدام خط الخلايا shSERBP1 3565 GSC (10 فئران لكل مجموعة). تلقت المجموعة التجريبية Dox للحث على التعبير عن shSERBP1. تشير منحنيات كابلان ماير إلى أن ضربة قاضية SERBP1 أدت إلى انخفاض نمو الورم وتوسيع نطاق البقاء على قيد الحياة. ي ممثل Ki67 تلطيخ من حدود الورم لكل مجموعة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر

بعد ذلك ، قمنا بتقييم تأثير SERBP1 على نمو الورم باستخدام طعم أجنبي داخل الجمجمة. اخترنا خط GSC 3565 شديد العدوانية [22] وأعدنا خطًا مستقرًا يحتوي على SERBP1 shRNA الذي يحفزه tet عن طريق العدوى الفيروسية البطيئة. أظهر تقييم هذا الخط في المختبر أنه يمكن تحقيق 80٪ ضربة قاضية عند العلاج بالدوكسيسيكلين. لوحظ انخفاض في تكوين الغلاف العصبي والبقاء على قيد الحياة عند العلاج بالدوكسيسيكلين والنتائج مرتبطة بكمية الدواء المستخدم (الملف الإضافي 1: الشكل S2C-F). تم زرع كل من المجموعة الضابطة والمجموعات التجريبية (5 ذكور و 5 إناث / مجموعة) بـ 3565 خلية SERBP1 shRNA-tet. في المجموعة التجريبية ، عولجت الخلايا بالدوكسيسيكلين قبل الزرع وسمح للفئران بشرب الماء المحتوي على الدوكسيسيكلين ad libitum. من خلال تقليل تعبير SERBP1 في المجموعة التجريبية ، قمنا بتمديد متوسط ​​البقاء على قيد الحياة بمقدار 11 يومًا مقابل مجموعة التحكم (ص = 0.0026) (الشكل 2 ط). أظهرت الأورام أيضًا مورفولوجيا مختلفة جدًا. كما ينعكس في المناعة مع مضاد Ki67 ، هناك فرق ملحوظ في عدد الخلايا شديدة الانتشار (الشكل 2 ي). ملف تعريف تعبير SERBP1 ، وتأثيره على بقاء المريض GBM ، والاستجابة للعلاج ، والأنماط الظاهرية للسرطان ونمو الورم ، يؤسس SERBP1 باعتباره RBP جديدًا للورم في GBM.

توصيف نموذج ربط SERBP1 والأثر التنظيمي

لتحديد تفضيلات ربط SERBP1 RNA ، استخدمنا RNAcompete [23]. تم تحضين بروتين SERBP1 المؤتلف كامل الطول مع مجموعة من

240،000 أوليجوس RNA مصمم (غير عشوائي). تم تحديد الحمض النووي الريبي الذي تم اختياره بواسطة SERBP1 عبر تهجين المصفوفة الدقيقة وحدد التحليل الحسابي اللاحق نموذجًا لربط الحمض النووي الريبي الغني بـ GC لـ SERBP1 (الشكل 3 أ). لقد عبرنا أيضًا عن SERBP1 وتنقيته باعتباره محطته N-terminus His6 بروتين الانصهار واستخدام الاستقطاب الفلوري (FP) لقياس تقاربه الملزم كميًا بـ RNA 7-mer (5′- GCGCGGG - 3 ′) ، تم تحديده بواسطة RNAcompete. ثابت تفكك التوازن المقاس (Kد) من تفاعل SERBP1-RNA (K.د

47 نانومتر) تؤكد تقاربها القوي مع التسلسل المحدد بواسطة RNA Compete (الشكل 3 ب). لتحديد ما إذا كان SERBP1 يرتبط بهذا الشكل في الخلايا ، أجرينا تجربة RIP-Seq. لاحظنا ذلك

40٪ من أنواع الرنا المرسال التي تم تحديد ارتباطها بـ SERBP1 تعرض الشكل الغني بالـ GC في 3 ′ UTR ، وهو رقم أعلى بكثير من المتوقع بالصدفة (الشكل 3 ج). النتائج الكاملة لتحليل RIP-Seq موضحة في (ملف إضافي 6: الجدول S5). أخيرًا ، اخترنا جينات متعددة "أشكال ربط SERBP1" في 3 UTR والتي تأثرت أيضًا بضربة قاضية SERBP1 (انظر تحليل RNA-Seq أدناه) لإجراء فحوصات لوسيفيراز. تم نقل مراسلون Luc الذين يحتويون على 3 UTR من هذه الجينات بشكل مشترك باستخدام ناقل أو عنصر تحكم SERBP1. في جميع الحالات ، زاد التعبير المعدّل وراثيًا لـ SERBP1 من تعبير مراسل لوسيفيراز (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، مما يشير إلى تعزيز استقرار mRNA و / أو ترجمة هذه النصوص.

شكل ربط SERBP1. أ تم الحصول على عزر ربط SERBP1 RNA باستخدام RNACompete. ب يُظهر اختبار الاستقطاب الفلوري تقارب SERBP1 العالي (K.د

47 نانومتر) إلى أليغنوكليوتيد الحمض النووي الريبي 7 مير (5′- GCGCGGG - 3 ′). ج

تعرض 40 ٪ من النصوص المحددة عبر RIP-Seq باعتبارها مرتبطة بشكل تفضيلي بـ SERBP1 الشكل الغني بالـ GC في 3 ′ UTR ، وهو رقم أعلى بكثير مما كان متوقعًا عن طريق الصدفة. د تظهر نتائج اختبار luciferase أن ترنسفكأيشن لمتجه التعبير SERBP1 زاد من التعبير عن بنيات المراسل التي تحتوي على 3 ′ UTR من الجينات التي تعرض أشكال ربط SERBP1 المفترضة. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم سلبي

SERBP1 هو منظم "استقلاب السرطان"

لفهم كيفية مساهمة SERBP1 في الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالسرطان ، أجرينا تحليل RNA-Seq في مجموعة التحكم مقابل خلايا SERBP1 ضربة قاضية U251. خفضت ضربة قاضية SERBP1 التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي وتنظيم التمثيل الغذائي كما هو موضح في أعلى شروط علم الوجود الجيني المخصب (الشكل 4 أ ، الملف الإضافي 7: الجدول S6). أظهر تحليل الشبكة أن هذه المجموعة من الجينات المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي مترابطة للغاية (الشكل 4 ب). وبالمثل ، حدد تحليل RIP-Seq أن النصوص المتعددة (الجينات) المرتبطة بـ SERBP1 متورطة في عملية التمثيل الغذائي (الملف الإضافي 7: الجدول S6). على وجه الخصوص ، يتأثر مساران استقلابيان مترابطان ، وهما التخليق الحيوي للسيرين ودورة الكربون الواحد (1C) ، بشدة بضربة قاضية لـ SERBP1 (الشكل 4 ج). تم التحقق من صحة التعبير المتغير للجينات المرتبطة بهذه المسارات بواسطة qRT-PCR واللطخة الغربية (الشكل 4 د ، هـ). أظهر المناعة من xenografts أيضًا أن ضربة قاضية SERBP1 أدت أيضًا إلى انخفاض كبير في تعبير PHGDH في الأورام (الشكل 4f).

ينظم SERBP1 عملية التمثيل الغذائي. أ مصطلحات علم الوجود الجيني المخصب (GO) المتعلقة بالجينات الخاضعة للتنظيم على SERBP1 في خلايا U251. تم تحليل مجموعة الجينات باستخدام Panther [24] وتم تجميع مصطلحات GO باستخدام Revigo [25] تم سرد المصطلحات الأكثر تمثيلا المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي. ب تحليل شبكة الجينات المتورطة في التمثيل الغذائي المتأثر بضربة قاضية لـ SERBP1. تم بناء الشبكة باستخدام سلسلة [26] مع الأخذ في الاعتبار التفاعل (دليل تجريبي) ، والتنقيب عن النص ، والتواجد المشترك. تم استخدام ألوان مختلفة للإشارة إلى العناقيد. ج تمثيل تخطيطي لدورة الكربون الواحد ، يُظهر الجينات المتأثرة بضربة قاضية لـ SERBP1. د, ه أكد تحليل qRT-PCR وتحليل اللطخة الغربية في خلايا U251 و U343 تأثير SERBP1 على التعبير عن الجينات الحرجة المتورطة في عملية التمثيل الغذائي. F التمثيل المناعي PHGDH التمثيلي للأورام من دراسة xenograft لكل مجموعة. شريط المقياس = 60 ميكرومتر

التمثيل الغذائي للكربون الواحد (1C) هو مسار عالمي يعتمد على حمض الفوليك وينتج وحدات 1C المستخدمة في تخليق de novo purine و thymidylate ، والتحويل البيني للعديد من الأحماض الأمينية ، وإنتاج مانحات الميثيل العالمية ، وتجديد العوامل المساعدة للاختزال ، وكلها تفيد السرطان. البقاء على قيد الحياة [27]. لقد تم بالفعل استكشاف استهداف بعض إنزيمات 1C كاستراتيجية علاجية [27،28،29]. تتضمن جينات 1C ذات الصلة PHGDH (3-phospho-glycerate dehydrogenase) ، SHMT2 (سيرين هيدروكسيل ميثيل ترانسفيراز 2) ، MTHFD2 (ميثيلين رباعي هيدروجيناز 2) ، PSAT1 (فوسفوسرين أمينوترانسفيراز 1) (الشكل 4 ب). في الخلايا السرطانية ، يتم استخدام 3-phosphoglycerate كجزء من آلية تعزيز النمو لتخليق السيرين والجليسين وتوليد NADPH. يتم استخدام نصف الكربون المشتق من الجلوكوز في التخليق الحيوي للسيرين ويعمل PHGDH باعتباره الإنزيم المحدد في هذه العملية [30]. يتم التعبير عن PHGDH بشكل مفرط في الورم الدبقي ويؤثر على الغزو وتكوين الأوعية [31]. SHMT2 هو إنزيم مهم في دورة 1C [32] ويتحكم في نقطة حرجة في التمثيل الغذائي للسرطان - اتجاه تحويل السيرين / الجلايسين. يمنع استنفاد السيرين تكاثر الخلايا السرطانية ويقلل من مستويات البيورين ، لوحظ تأثير مماثل بعد ضربة قاضية SHMT2 [27]. MTHFD2 هو إنزيم معتمد على NAD + مع نشاط ديهيدروجينيز وسيكلوهيدرولاز المتورط في استقلاب الفولات 1C في الميتوكوندريا وهو أحد الإنزيمات الأيضية الأكثر شيوعًا في الأورام [33]. PSAT1 هو إنزيم مهم في المسار الفرعي الذي يصنع L-serine من 3-phospho-D-glycerate. يرتبط تعبير PSAT1 العالي بسوء التشخيص في العديد من الأورام بما في ذلك سرطان الثدي وسرطان القولون والمستقيم والبلعوم الأنفي وسرطان المريء ويرتبط بمقاومة الأدوية [34،35،36،37].

أجرينا دراسة أيضية لتأكيد نتائج تحليل RNA-Seq. نظرًا لأن ضربة قاضية SERBP1 siRNA أثرت بشكل ملحوظ على الصلاحية وموت الخلايا المبرمج ، فقد اخترنا استخدام خط ثابت U251 مع shRNA الذي يحفزه tet. يُظهر تحليل المكون الرئيسي (PCA) الذي تم إجراؤه على بيانات التمثيل الغذائي فصلًا واضحًا بين مجموعة التحكم ومجموعات الضربة القاضية SERBP1 (الملف الإضافي 1: الشكل S4A-B). تُظهر بيانات مؤامرة البركان استنفادًا كبيرًا لمواد وسيطة دورة الميثيل (S-adenosylhomocysteine ​​و methionine) وتراكم وسيطة دورة 5-methylthioadenosine (MTA) (بوتريسين و N-acetylputrescine) (ملف إضافي 1: الشكل S4C). أكدت التحليلات الأيضية أن SERPB1 ينظم استقلاب السيرين ويتداخل مع نقل وحدة الكربون الواحد (C1) من دورة الفولات إلى دورة الميثيل. يمكن أن يغير هذا التغيير مثيلة الحمض النووي / هيستون ، وتجديد العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال ، والتخليق الحيوي للنيوكليوتيدات [27 ، 38 ، 39]. يتضح التأثير من الاستنفاد الكبير لميثيونين و S-adenosylhomocysteine ​​(SAH) ، المنتج الثانوي للميثيون الذي يعيد تدوير الميثيونين من خلال مساهمة مجموعة الميثيل من دورة 1C وسيطة ميثيل رباعي هيدروفولات (ميثيل- THF) (الشكل 5 أ ، ج) والملف الإضافي 1: الشكل S4). ارتبطت المستويات العالية من الميثيونين في الخلية ، وكذلك النظم الغذائية الغنية بالميثيونين ، بتطور الورم [40 ، 41]. من ناحية أخرى ، فإن التنظيم الكبير لسلائف البوليامين ، البوتريسين ، و N-acetyl putrescine يشير إلى عدم توفر الميثيونين ومستقلبه S-adenosylmethionine (SAM) SAM الذي يوفر مجموعة البروبيل الأمينية لبوتريسين لتخليق البوليامين خلال دورة MTA [ 42]. علاوة على ذلك ، يرتبط استنفاد السيستين بتقليل تنظيم السيستاثيونين- بيتا-سينثيز (CBS) الذي يحفز التخليق الحيوي للسيستين من SAH ، مع وجود الهوموسيستين والسيستاثيونين كمواد وسيطة [38].

تأثير SERBP1 على دورات الكربون الواحد والميثيل والتأثيرات النهائية المحتملة. أ يُظهر التحليل الأيضي أن إسكات SERBP1 أثر على إنتاج المستقلبات المرتبطة بدورات الكربون الواحد والميثيل و MTA. ب مستويات الجلوتاثيون داخل الخلايا بعد إسكات SERBP1. ج نموذج لتأثير SERBP1 على التمثيل الغذائي وتأثيرات المصب الوظيفي

تم تحديد انخفاض في المستويات الإجمالية للجلوتاثيون بواسطة مقايسة تعتمد على الإنارة (الشكل 5 ب). نظرًا لأن السيستين هو مقدمة للجلوتاثيون (GSH) ، وهو مستقلب منظم للأكسدة والاختزال ، فقد يؤثر استنفاده على توازن الأكسدة والاختزال في خلايا ضربة قاضية لـ SERPB1 (الشكل 5 ج). وبالمثل ، استنفاد كبير من أنزيم Q10 (CoQ10ح2) أو CoQ عالية10/ CoQ10ح2 تشير النسبة في مجموعة ضربة قاضية إلى خلل في تنظيم سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا (mETC) ، وتثبيط الفسفرة المؤكسدة ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج [43]. CoQ10 is a lipophilic redox cofactor that functions as an electron carrier in the mETC and generates the proton gradient that drives ATP synthesis through oxidative phosphorylation [44] (Fig. 5a, c). In summary, the results of the metabolic analysis support the changes observed in the genomic study, establishing SERBP1 as a novel regulator of metabolic pathways. Full results of the metabolic analysis are shown in (Additional File 8: Table S7).

SERBP1 impact on neuronal differentiation, “stemness,” and epigenetic regulation

Genes upregulated after SERBP1 knockdown are preferentially associated with nervous system development, neurogenesis, and synaptogenesis according to GO analysis (Fig. 6a, b Additional File 1: Fig. S5, Additional File 7: Table S6). This data suggests that SERBP1 could function as a “repressor” of neuronal differentiation. In fact, according to our previous analysis [46], most of these genes show an increase in expression during neurogenesis (Fig. 6c). SERBP1 shows the opposite pattern NSCs and GSCs display high levels of SERBP1 while decreased expression occurs when cells are induced to differentiate (Fig. 6d, Additional File 1: Fig. S6A-B). Next, we performed gene expression correlation analyses with R2 using TCGA GBM and brain samples. Genes showing strong negative correlation with SERBP1 are found in many GO-enriched categories previously identified in analyses of genes upregulated upon SERBP1 knockdown (e.g., synapse organization, nervous system development, and neurogenesis) (Additional File 9: Table S8, Additional File 10: Table S9). Overall, these results suggest that SERBP1 represses neuronal differentiation. We then evaluated whether increased SERBP1 expression can disrupt neuronal differentiation using the neuroblastoma BE-(2)-C cell line. Cells were infected with either SERBP1 expressing or control lentivirus and treated with or without retinoic acid (RA) to induce differentiation. After 4 days, we used an Incucyte system to measure neurite outgrowth as an indicator of differentiation. RA treatment effectively induced neurite formation but SERBP1 overexpression diminished the effect (Additional File 1: Fig. S6C-E).

SERBP1 knockdown increased expression of genes linked to neurogenesis and nervous system development. أ Enriched Gene Ontology terms related to genes upregulated upon SERBP1 knockdown in U251 cells. Gene set was analyzed using Panther [24] and GO terms were compiled using [25]. Most representative terms associated with nervous system development and function are listed. ب Network analysis of genes implicated in neuronal differentiation affected by SERBP1 knockdown. The network was built using String [26] considering interaction (experimental evidence), text mining, and co-occurrence. Different colors were used to indicate clusters. ج Heatmap shows that genes upregulated upon SERBP1 knockdown cells display increased expression during murine neurogenesis—0 day/stem vs. 4 days/differentiated cells. د qRT-PCR shows SERBP1 and β-III Tubulin expression in neuronal stem cells (NSCs) and differentiated cells. ه Genes upregulated upon SERBP1 knockdown showing decreased expression in GBM in reference to LGG are labeled in blue, genes that show reduced expression in GBM in reference to normal brain (cortex) are labeled in green and genes that are methylated (H3K27me3) in GBM cells [45] are labeled in orange. F Western blot showing that SERBP1 knockdown leads to a decrease in H3K27me3 in GBM cells

The effect of SERBP1 on methionine production could ultimately influence histone and/or DNA methylation. Therefore, SERBP1 could function as an epigenetic modulator, indirectly repressing the expression of genes implicated in neuronal differentiation. Gene set enrichment analysis (GSEA) identified strong similarities between the list of upregulated genes in SERBP1 knockdown cells and binding profiles of H3K27me3 and EZH2 and SUZ12, two members of PRC2 which trimethylate histone H3 on lysine 27 (Additional File 11: Table S10). Analysis of H3K27me3 profiles in GBM cells [45] confirmed that several genes “repressed” by SERBP1 show H3K27me3 sites (Fig. 6e, Additional File 12: Table S11). Consistent with these results, levels of expression for most of these genes are decreased in GBM samples in comparison to brain (cortex) and LGG (Fig. 6e, Additional File 13: Table S12. Corroborating the association between SERBP1 and H3K27me3, we determined by Western analysis that SERBP1 knockdown in GBM cells reduced H3K27me3 levels (Fig. 6f).

We then tested if a reduction in SERBP1 levels could increase GBM cell sensitivity to PRC2 inhibition. EED226 is a potent and selective PRC2 inhibitor that directly binds to the H3K27me3 binding pocket of EED. Control and SERBP1 knockdown cells were treated with 20 or 40 μM of EED226 and cell proliferation was followed over time with an Incucyte. Since the impact of SERBP1 on cell proliferation is very strong, we decided to use a partial SERBP1 knockdown (40–50% reduction in proliferation) to appreciate the effect of combined treatment. While control cells showed almost no response to EED226 treatment, SERBP1 knockdown cells showed decreased proliferation in response to treatment (Additional File 1: Fig. S7A,S7C). To better illustrate the differences between siRNA control and SERBP1 knockdown cells, we show proliferation at the terminal time point, comparing EED226-treated cells to its respective untreated control (Additional File 1: Fig. S7B, S7D).

In line with these findings, we observed that SERBP1 knockdown decreased expression of several genes associated with PI3K/AKT signaling (Additional File 1: Fig. S8A, Additional File 7: Table S6) which has been shown to modulate the cancer epigenome through methylation [47]. Corroborating the connection between SERBP1 and the PI3K/AKT pathway, knockdown of SERBP1 reduced levels of AKT and p-AKT in U251 and U343 cells as observed by Western blot (Additional File 1: Fig. S8B). Finally, using the glioma cohort from the Shanghai Changzheng, we determined that AKT1 and SERBP1 display good expression correlation based on immunostaining (Additional File 1: Fig. S8C).

Finally, we examined whether increased expression of SERBP1 could contribute to stem cell features. We generated, via lentiviral infection, a U343 line that overexpresses SERBP1 (SERBP1 OE) (Additional File 1: Fig. S2G-H). Control (empty vector) and SERBP1 OE cells were grown as neuro-spheroids in stem cell media. SERBP1 OE cells were more efficient in forming spheres than controls and the difference increased in higher passages (Additional File 1: Fig. S9A-B). SERBP1 OE cells also showed increased expression of stem cell markers by qRT-PCR (Additional File 1: Fig. S9C). Increased metabolism and radio-resistance are characteristics of “cancer stem cells” [48]. We observed that SERBP1 OE cells also had increased mitochondrial respiration and ATP production compared to controls (Additional File 1: Fig. S9D-E). Consistent with the finding that that high SERBP1 expression influences response to radiation in GBM patients (Fig. 1G), SERBP1 OE cells were more resistant to radiation than controls as shown in a colony formation assay (Additional File 1: Fig. S9F).

Overall, our results indicate that SERBP1 contributes to GBM poorly differentiated state and glioma stem cell phenotypes by repressing genes implicated in neuronal differentiation and neuronal function. SERBP1 could influence epigenetic regulation by controlling methionine production via the one-carbon and methyl cycles and the AKT pathway.


الملخص

Fatty acid, polyketide, and nonribosomal peptide biosynthetic enzymes perform structural modifications upon small molecules that remain tethered to a carrier protein. This manuscript details the design and analysis of cross-linking substrates that are selective for acyl carrier proteins and their cognate condensing enzymes. These inactivators are engineered through a covalent linkage to fatty acid acyl carrier protein عبر post-translational modification to contain a reactive probe that traps the active site cysteine residue of ketosynthase domains. These proteomic tools are applied to الإشريكية القولونية fatty acid synthase enzymes, where KASI and KASII selectively cross-link ACP-bound epoxide and chloroacrylate moieties. These mechanism-based, protein–protein fusion reagents also demonstrated cross-linking of KASI to type II polyketide ACPs, while nonribosomal peptide carrier proteins showed no reactivity. Similar investigations into protein–protein interactions, proximity effects, and substrate specificities will be required to complete the mechanistic understanding of these pathways.


مناقشة

IL-1β is a pro-inflammatory cytokine involved in various liver diseases [6]. In this study we report that pre-treatment of hepatocytes with IL-1β enhances FasL-induced caspase-3/-7 activity, but astonishingly diminishes FasL-induced apoptosis. In the literature, contrary effects of IL-1β on cell viability are described. ان في الجسم الحي study demonstrated that a pre-treatment of mice with IL-1β protected the animals from subsequent liver injury by Fas-dependent apoptosis. These mice showed decreased liver enzyme serum concentrations, reduced caspase-3/-7 activity levels and prolonged survival [3]. On the other hand, in pancreatic MIA PaCa-2 cells IL-1β mediated cell death by triggering the phosphorylation of JNK due to ER stress [30].

Our results demonstrate that treatment of hepatocytes with IL-1β alone resulted in a time-dependent phosphorylation of JNK1/2, which was previously described in mouse embryonic fibroblasts and in the rabbit liver [31], [32]. This JNK1/2 activation was essential for the crosstalk of IL-1β in the presence of FasL as its inhibition, but not that of p38 MAPK, abolished the increase in caspase-3/-7 activity that was mediated by IL-1β pre-treatment. JNK is known to be crucial for modulating the activity of pro-apoptotic BH3-only proteins. في المختبر و في الجسم الحي (thymus) studies showed that Bim and Bmf were phosphorylated by JNK in response to UV or during thymic selection [23]. Similarly, we recently reported that gliotoxin, a fungal toxin of دخان الرشاشيات, induced apoptosis via JNK1/2-mediated phosphorylation of Bim at three sites (S100, T112 and S114) [24]. Bim phosphorylation by JNK1/2 was shown to increase its binding affinity to Bcl-2-like survival factors which translated into a better activation of Bax/Bak with subsequent cytochrome c release and caspase-3/-7 activation [23], [24]. In agreement with this, we could observe increased caspase-3/-7 levels after stimulation with IL-1β + FasL, and this response was abrogated in Bim -/- hepatocytes as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. In addition to Bim, we showed that Bid was crucial for the increased caspase-3/-7 activity. Bid -/- hepatocytes were unable to increase caspase-3/-7 activity upon IL1β + FasL treatment, thus preserving cell viability.

Our experimental observations are supported by a mathematical model, which was established to confirm that our network structure covers the observed effects in all scenarios and explains the underlying mechanism. The model indicates that the sensitizing is due to a depletion of free anti-apoptotic Bcl-2 proteins after tBid and Bim were formed and/or activated in response to IL-1β and FasL treatment. FasL contributes to apoptosis by cleaving full-length Bid into the pro-apoptotic tBid form, whereas IL-1β enhances the pro-apoptotic activity of Bim by JNK1/2-mediated phosphorylation (pBim). tBid and pBim bind to anti-apoptotic Bcl-2 proteins with high affinities. Hence, when cells are treated with FasL or IL-1β alone, either one of the BH3-only proteins is fully sequestered by Bcl-2 proteins. However, if both stimuli are present, the Bcl-2 protein buffer is insufficient to block tBid and pBim simultaneously leading to free amounts of the BH3-only proteins which can then directly activate Bax/Bak and trigger MOMP, cytochrome c release and increased caspase-3 activation. Thus, IL-1β sensitizes hepatocytes to FasL-induced caspase-3/-7 activation by shifting the balance from anti- to pro-apoptotic Bcl-2 proteins. The crucial role of Bid, Bim and JNK1/2 was further emphasized by simulating the knockout and inhibition scenarios. MOMP was ablated in both Bid -/- and Bim -/- knockout cells as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. While in Bid -/- cells, blockage of MOMP was because FasL could not trigger tBid formation, in Bim -/- cells and wt hepatocytes treated with SP600125 IL-1β was unable to favour MOMP via Bim phosphorylation. However, the question remained how IL-1β could increase FasL-induced caspase-3/-7 activation but at the same time attenuate FasL-induced cell death.

The threshold for MOMP-activation may significantly vary in individual cells within a population [33]–[35]. The intracellular ratio of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins determines the susceptibility of individual cells to apoptotic stimuli [36], [37]. Furthermore, Kallenberger et al. described heterogeneous caspase-8 activation in individual cells following FasL stimulation that critically depended on the quantity of FasL - Fas interaction and DISC formation [29]. We observed that only a fraction of hepatocytes died after 3 h of FasL treatment, whereas others appeared resistant to the stimulus. Our mathematical simulations showed that this heterogeneity may be explained by the dependence of caspase-3 activation and thus cell fate on different initial protein levels of Fas and Bcl-2. Accordingly, IL-1β pre-treatment favors MOMP-mediated apoptosis by influencing the Bcl-2 balance and thus promotes increased caspase-3 activity, but only in those cells which are susceptible to FasL-induced cell death anyway. Thereby, IL-1β pre-incubation leads to higher average caspase-3 levels but not to increased cell death. Our model predicts that pre-incubation with IL-1β changes the ratio of survivors, type I cells and type II cells. This could be verified by monitoring single cell responses to FasL and IL-1β + FasL stimulation distinguishing between type I and type II cells. So far the missing increase of PARP cleavage, the downstream event of caspase-3/-7 activation, supports our hypothesis.

We observed an enhancement of NF-㮫 DNA binding activity and induction of the NF-㮫 target gene A20 after treatment with IL-1β + FasL, whereas NF-㮫 DNA binding activity and A20 mRNA induction was reduced when IL-1β was substituted by TNFα ( Figs. 8 and ​ and9A). 9A ). Enhanced expression of A20 could be confirmed on the protein level ( Fig. 9 B-D ). This might explain increased cell viability of IL-1β + FasL treated hepatocytes. A20 is an inhibitor of caspase-8 activation and thereby can mediate a protective effect on FasL-induced apoptosis [28]. In our mathematical model, expression of the protective protein X that could be A20 can explain decreased caspase-3 activity in Bid -/- hepatocytes treated with IL-1β + FasL as well as increased cell viability in wt cells after treatment with IL-1β and FasL ( Fig. 13B ).

In addition to NF-㮫 activation and increased expression of A20 other survival signaling such as the PI3K/Akt pathway might be crucial for IL-1β-mediated protection. For example, active caspase-3 may trigger Akt activation and protection from apoptosis by proteolytic cleavage of RasGAP to a N-terminal fragment [38]. Furthermore, proteins that directly associate with active caspases and block their proteolytic activity such as the HGF-receptor domain, survivin or XIAP may suppress cell death induced by FasL [12], [39], [40]. Our results with XIAP - / - hepatocytes did not reveal any implication of XIAP in the IL-1β–mediated survival response. Whether Akt or other cellular caspase inhibitors are involved in the protective effect remains to be elucidated.

Altogether, we characterized the IL-1β-mediated sensitizing effect on FasL-induced caspase-3/-7 activation via comprehensive studies. Based on our experiments and according to our mathematical model it can be assumed that IL-1β exerts two distinct effects on FasL-induced apoptosis. On one hand it shifts the balance of Bcl-2 proteins to favoring MOMP and increasing the average caspase-3/-7 activity. On the other hand this pro-apoptotic effect is minimized by elevating A20 levels, which may reduce caspase-8 activation and further caspase-3 activation. Therefore, cells that show only a weak response to FasL stimulation and low caspase-8 levels could be rescued by a pre-incubation with IL-1β resulting in elevated cell viability. Moreover, we hypothesize that the seemingly contradictory results of increased caspase-3/-7 activity but decreased cell death do not represent the situation in a single cell but the average of a cell population.


THE EFFECTS OF PROTEIN BINDING ON THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF THE MEMBRANES

Proteins have a limited number of interaction partners and often display their functions through bimolecular interactions. However, biological membranes display physical properties that cannot be explained at the single-molecule level. For example, membranes display trans-bilayer coupling, phase behavior, and elasticity. The chemical composition of the bilayer affects its mechanical properties and, conversely, membranes adapt their compositions such that the physical properties are maintained when external conditions change (Janmey and Kinnunen, 2006). Peripheral membrane proteins can cause changes in the physicochemical properties of the membranes, such as alterations in membrane fluidity and phase behavior, and can induce formation of lipid microdomains.

Protein-induced lipid clustering can be studied by fluorescence spectroscopy using an acyl chain–labeled lipid molecule such as BODIPY-PI(4,5)P2 (Gambhir وآخرون.، 2004). This fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. If protein binding induces the formation of PI(4,5)P2 microdomains, BODIPY-PI(4,5)P2 molecules are clustered together, resulting in intramolecular self-quenching (Figure 4). In addition to BODIPY-labeled lipids, pyrene-labeled phospholipids can be applied to study lipid microdomain formation upon protein binding (Pap وآخرون., 1995 Kinnunen and Holopainen, 2000). It is important to note that fluorometric lipid-clustering assays are very sensitive to small environmental changes for example, divalent cations induce phosphoinositide clustering in model membranes (Wang وآخرون.، 2012). Thus such assays should always be carried out with proper controls and special attention should be paid to ensure no changes in the buffer conditions occur during the assay.

FIGURE 4: Detection of PI(4,5)P2 microdomain formation by a fluorometric assay using BODIPY-PI(4,5)P2.Interaction of a protein in a multivalent manner with specific lipids (e.g., PI(4,5)P2) may induce lipid clustering. Furthermore, oligomerization of membrane-binding proteins may induce clustering of specific lipid molecules. The BODIPY fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. Upon lipid clustering, BODIPY-labeled lipids (e.g., PI(4,5)P2) form excimers, which results in intramolecular self-quenching of the BODIPY fluorescence. This change in BODIPY fluorescence can be applied for studying the effects of a protein on clustering of specific BODIPY-conjugated lipid species.

Other lipid probes, such as laurdan, prodan, and pyrene, are extensively used in studies concerning structural and dynamical properties of membranes (e.g., phase behavior, lipid order, membrane fusion). These probes can be incorporated into the lipid bilayer either alone or covalently linked to fatty acids. They locate at different depths in the bilayer and display distinct photophysical properties. Pyrene-labeled phospholipids are commonly used for studying lateral diffusion and segregation of lipids, as well as for membrane fusion assays (Kinnunen and Holopainen, 2000). Laurdan and prodan probes are sensitive to the physical state of the surrounding lipids, and are thus applied to study changes in lipid order and membrane-phase behavior (Parasassi وآخرون., 1998 Krasnowska وآخرون., 1998 Kaiser وآخرون., 2009).


أساليب

Sequence alignment and family tree construction

Amino acid sequence alignments and family tree construction were performed by Genstruct, Inc. (Cambridge, MA, USA). Amino acid sequences were obtained from annotated protein sequence files obtained from the NCBI reference proteins database, RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) or from Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot/) ( 14 ). Rigorous identification of family member sequences was accomplished using position-specific iterated basic local alignment search tool ( psi-blast ) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Multiple sequence alignments for each family group were generated using the clustalw 2 software (http://www.clustal.org). Visualization and manual editing of alignments were performed using GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/). Interfamily sequence alignment was accomplished using a ‘sparse alignment’ approach [S. Smith (2009), personal communication] that aligns representative members of each family using clustalw 2 to define appropriate anchor points for the interfamily alignments. The final alignments were generated by manually adding additional proteins to the alignment, ensuring alignment of key anchor points identified in the sparse alignments. The final multiple sequence alignments used for the phylogenetic analysis are illustrated in the supplemental materials as Figures S1 and S2 for the PKMTs and the PRMTs (plus DOT1L), respectively.

The phylogenetic analysis of the aligned sequences was accomplished using the phylip package developed at the University of Washington (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). To facilitate bootstrap analysis of the data, the seqboot program was used to create 250 randomized data representations of the input alignment for analysis. The protdist program was used to calculate pairwise distance measures between the sequences within the alignments using the blosum 45 matrix, and the program neighbor was used to construct phylogenetic trees from the distance data using the neighbor joining method. Consensus trees were built using the consense utility and uprooted trees were drawn using the drawtree program.

Determination of PMT enzymatic activity

Recombinant protein production and activity assays were performed for the 11 PMTs as described elsewhere ( 15 S. R. Daigle, E. J. Olhava, C. A. Therkelsen, C. R. Majer, C. J. Sneeringer, J. Song, D. Johnston, M. Porter Scott, J. J. Smith, Y. Xiao, L. Jin, K. W. Kuntz, R. Chesworth, M. P. Moyer, K. M. Bernt, S. A. Armstrong, R. A. Copeland, V. M. Richon, R. M. Pollock, unpublished data).

Determination of inhibitor IC50 القيم

IC50 values for enzymes in the protein methyltransferase panel were determined under balanced assay conditions with both SAM and protein/peptide substrate present at concentrations equal to their respective كم القيم. Where a peptide was used as methyl-accepting substrate, the peptide is referred to here by the histone and amino acid residue numbers that it represents. For example, peptide H3:16–30 refers to a peptide representing histone H3 amino acid residues 16 through 30. Flag and his-tagged CARM1 (2–585) purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 0.25 n m against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:16–30 (R26-Me1). E. coli-expressed EHMT2 (913–1193) was assayed at a final concentration of 0.1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Full-length EZH1 and EZH2 were expressed as four-component complexes in insect cells and purified as described elsewhere ( 15 ). EZH1 (4 n m ) and EZH2 (4 n m ) four-component complexes were assayed against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:21–44. Insect expressed full-length PRMT1 was assayed at a final concentration of 0.75 n m against biotinylated peptide corresponding to H4:36–50. Flag-tagged full-length PRMT5 purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:1–15. بكتريا قولونية-expressed full-length PRMT8 was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:31–45. Full-length SETD7 purified from بكتريا قولونية was assayed at a final concentration of 1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Flag and his-tagged full-length WHSC1 was purified from 293 الخلايا and assayed at a final concentration of 2.5 n m against avian oligonucleosomes.

Determination of METTL11A enzymatic activity

Histone H3 and Histone H4 (NEB, Ipswich, MA, USA) were diluted separately in assay buffer (20 m m Tris, pH 8.0, 0.002% Tween20, 0.005% bovine skin gelatin, and 0.5 m m DTT) to a final concentration of 200 n m in a 96-well plate (25 μL each well). To monitor the reaction, 300 n m S-[methyl- 3 H]-adenosyl- l -methionine (80 Ci/mmol, from ARC) together with 200 n m cold SAM (total SAM concentration = 500 n m ) was used in each reaction. For initial determination of activity, METTL11A (Sino Biologics, Beijing, China) was added to initiate the reaction (25 μL each well for final concentration of 50 n m ). The reaction was incubated at room temperature and quenched with 10 μL per well of 300 μ m unlabeled S-adenosyl- l -methionine (Sigma, St. Louis, MO, USA) at various time-points. For detection, 50 μL of reaction was transferred to a filter plate [Millipore (Billerica, MA, USA) Multiscreen HTS FB 1.0/0.65 μm], washed three times with 10% trichloroacetic acid, washed once with 95% ethanol, and read on the Top Count (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) after the addition of 30 μL scintillant. Having established histone H4 as the preferred substrate, the enzyme concentration was titrated from 5 to 40 n m , and the reaction progress over time was determined at each enzyme concentration as described previously.

Structure determination of DOT1L with SAH or SAM bound

DOT1L-1-416 was produced in بكتريا قولونية as either a GST or hexa-histidine N-terminal fusion protein. The GST-DOT1L-1-416 was cloned into the pGEX-KG vector and expressed in BL21 (DE3) cells (Novagen, Madison, WI, USA) with coexpression of chaperone plasmid pGTf2 (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) with 0.2 m m isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG), at 18 °C for 16 h. Cell pellets were suspended in buffer containing 50 m m Na2HPO4/NaH2ص4, pH 7.5, 200 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. Cells were lysed by sonication. The supernatant was loaded onto a column of glutathione-sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA). Protein was eluted with buffer containing 10 m m reduced glutathione. The GST-tag was cleaved from DOT1L-1-416 by thrombin and removed by a second run on a glutathione-sepharose column. The tag-free protein was purified further by SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chromatography and eluted with 25 m m Tris–HCl, pH 8.0, 675 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. The protein was further purified by Superdex75 (GE Healthcare) chromatography in buffer containing 20 m m Tris–HCl, pH 8.0, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, and 1 m m dithiothreitol. Fractions of pure protein were pooled and concentrated to 40 mg/mL for crystallization work. The His-DOT1L-1-416 was cloned into pET30a vector with N-terminal His tag and expressed in BL21-Gold (DE3) (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA). The culture was incubated at 37 °C until OD600 reached 0.3 and continued at 25 °C until OD600 reached 0.7. Expression was induced by adding 0.2 m m IPTG, and cells were harvested after 4 h. Cell pellet was suspended in buffer A (20 m m Tris–HCl, 500 m m NaCl, 10 m m imidazole, 10% glycerol, 5 m m β-mercaptoethanol, pH 7.8) with 1 mg/mL lysozyme and incubated on ice for 30 min. The cells were sonicated and centrifuged. The supernatant was loaded onto Ni-NTA column (Qiagen, Valencia, CA, USA) that preequilibrated with buffer A and washed with the same buffer. Protein was eluted with 200 m m imidazole in the buffer A and then dialyzed against 20 m m HEPES, 50 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.5. The sample was loaded on a SP Sepharose Fast Flow column (GE Healthcare) and eluted with a linear gradient of 0–1 m NaCl. The target protein was concentrated and further purified by Superdex200 column (GE Healthcare) with 20 m m HEPES, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.8. Fractions of pure protein were pooled.

SAH or SAM (Sigma-Aldrich) was dissolved in the final DOT1L protein buffer to 100 m m . The DOT1L–SAH or DOT1L–SAM binary complex was prepared at a final concentration of DOT1L of 20 mg/mL (0.4 m m ) and SAH or SAM of 2 m m . Crystals were obtained in 1.94 m ammonium sulfate, 0.1 m sodium acetate, pH 5.3, and 2 m m TCEP by the hanging-drop method at 18 °C. The crystals were cryoprotected in 30% glucose and flash-frozen in liquid nitrogen. The diffraction data set for DOT1L–SAH was collected at beamline 17 U at Shanghai Synchrotron Radiation Facility and the data set for DOT1L–SAM was collected at beamline 21-ID-F at Advanced Photon Source in Argonne National Laboratory. All data were processed by HKL2000 ( 16 ). The SAH-bound crystal diffracted to 2.3 Å and the SAM-bound crystal diffracted to 2.1 Å, in the space group of P65 with one protein molecule in the asymmetric unit. The structures were solved by molecular replacement (Molrep) ( 17 ) using the published DOT1L–SAM structure (PDB ID: 1NW3) as a search model ( 18 ). Refinement was carried out by Refmac5 ( 19 ), and the model building was carried out by COOT ( 20 ). Detailed information on the diffraction data, refinement, and structure statistics is provided in Table S1.

The enzyme thus purified was tested for enzymatic activity in a radiometric assay of 3 H-CH3 transfer from labeled SAM (Perkin-Elmer) to purified nucleosomes from chicken erythrocytes according to the method of Fang وآخرون. ( 21 ). The DOT1L used for crystallographic studies was found to have reproducible activity as a histone methyltransferase and displayed the following steady state kinetic parameters: كقط = 0.3 per minute, = 0.67 μ m , = 8.6 n m , = 0.26 μ m . A more complete description of the enzymatic mechanism of DOT1L will be reported separately (A. Basavapathruni, C. R. Majer, R. A. Copeland and M. Porter Scott, manuscript in preparation).


Parallel single-cell analysis of active caspase-3/7 in apoptotic and non-apoptotic cells

Analysing the chemical content of individual cells has already been proven to reveal unique information on various biological processes. Single-cell analysis provides more accurate and reliable results for biology and medicine than analyses of extracts from cell populations, where a natural heterogeneity is averaged. To meet the requirements in the research of important biologically active molecules, such as caspases, we have developed a miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells. A stainless steel body with a carousel holder enables high-sensitivity parallel detections in eight microvials. The holder is mounted in front of a photomultiplier tube with cooled photocathode working in photon counting mode. The detection of active caspase-3/7, central effector caspases in apoptosis, in single cells is based on the bioluminescence chemistry commercially available as Caspase-Glo ® 3/7 reagent developed by Promega. Individual cells were captured from a culture medium under microscope and transferred by micromanipulator into detection microvial filled with the reagent. As a result of testing, the limits of detection and quantification were determined to be 0.27/0.86 of active caspase-3/7 content in an average apoptotic cell and 0.46/2.92 for non-apoptotic cells. Application potential of this technology in laboratory diagnostics and related medical research is discussed.

Miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


Neurotransmitter Function Presynaptic Neurotransmission: Alterations in Exocytotic/Secretory Machinery and Glutamate Signaling in Kindling☆

Asymmetric Accumulation of SNARE Complexes (7SC)

We have examined the state of the SNARE proteins and several of the SNARE regulators in hippocampi from kindled animals. Initial studies showed an asymmetric accumulation of 7SCs in ipsilateral hippocampal synaptosomes prepared from animals kindled by entorhinal stimulation ( Matveeva et al., 2003 ). Control experiments suggest that this ispsilateral buildup of 7SCs is a marker of some basic biochemical change occurring during kindling and is indicative of epileptogenesis. Asymmetric accumulation cannot be induced by electroconvulsive shock nor is it seen in synaptosomes prepared from tissues outside of the limbic system, eg, cerebellum or occipital cortex. It can be induced by stimulating at several different sites including entorhinal cortex, septal region and amygdala it develops in the ipsilateral hippocampus regardless of whether the right or left hemisphere is stimulated ( Matveeva et al., 2007 ). As with kindling, asymmetric 7SC accumulation is not simply a shock burst response, but requires time to evolve and stimulation within a frequency range that promotes kindling. The accumulation occurs gradually during kindling, mirroring the progression of Racine behavioral stages ( Fig. 1 A), but it is persistent and can still be detected up to 1 year after attaining a minimally kindled state defined as two successive Stage 5 seizures ( Matveeva et al., 2008 ). It appears that a certain minimal level of kindling induction is necessary to induce permanence of the 7SCs asymmetry. In animals advancing up to but not beyond Stage 3, the asymmetry begins to develop. If they receive no further stimuli, by 1 month after the last stimulation hippocampal 7SCs symmetry is regained ( Fig. 1 B). Further, we have shown that kindling and 7SC asymmetric accumulation is associated with an increase in the amplitude of spontaneous glutamate release in the ipsilateral DG, a decrease in amplitude in the ipsilateral CA3, and no changes in signaling in the ipsilateral CA1 of the rat hippocampus ( Matveeva et al., 2012a ). Interestingly, the frequency of glutamate release in the ipsilateral DG is smaller than that seen in the ipsilateral CA1. Thus, kindling seems to alter glutamatergic signaling in multiple areas of the hippocampus and which change occurs is location specific (ie, an increase in release quanta versus an increase in the frequency of release events).

شكل 1 . Asymmetric SNARE Complex (7SC) Accumulation Correlates with Kindling Stage. A) Animals were electrically kindled by amygdalar (open squares) or entorhinal cortical (closed squares) stimulation until they exhibited behavior consistent with the indicated Racine Stages. The next day, hippocampi were harvested from each animal and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured. One set of animals was fully kindled and hippocampi were harvest after 1 month (30 days). (B) Four cohorts of animals were held as naïve (no stimulation), kindled to Stage 2 by amygdalar (open bars), or kindled to Stage 4 by either amygdalar (hatched bars) or entorhinal cortical (solid bars) stimulation. Hippocampi were harvested from the animals either 1 day post stimulation or 1 month post stimulation and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured.

Once attained, the asymmetric accumulation of 7SCs is the most stable biochemical marker of kindling-induced epileptogenesis that we have been able to find in the literature ( Matveeva et al., 2008 ) It is not clear whether عبر- أو رابطة الدول المستقلة-7SCs accumulate. إذا كانوا كذلك عبر-7SCs, it represents an increase in engagement of the membrane fusion machinery and our observations might be consistent with a focal enhancement of NT release. لو رابطة الدول المستقلة-7SCs accumulate, it might signal defective recycling machinery, although this would not be entirely consistent with the observed increases in NT release, particularly glutamate, measured in hippocampi from patients undergoing epilepsy surgery, in several reported seizure models, and the studies reported here.

At this stage of our investigations it is unclear whether the accumulation of 7SCs is merely an association or is part of a cause-effect relationship, either a driver of the kindled state or a sequela of the process. The control experiments described above demonstrate the tight correlation between kindling and asymmetric complex accumulation, but as discussed below, at least one anti-epilpetic drug can separate accumulation from kindling behavior. Further analysis with transgenic mice expressing reduced SNARE levels or defective SNARE regulation may prove to be a useful strategy to lower the availability of SNAREs and thus decrease the formation of 7SCs. Determining whether these conditions affect kindling progression might at least address whether complex accumulation is causative, responsive, or simply correlative. Either of the first two situations would indicate a locus for modification with agents useful to arrest epileptogenesis or quell epilepsy.


شاهد الفيديو: التركيب الكيميائي للبروتينات: البنية الأولية والثانوية والثالثية والرابعية للبروتين (قد 2022).