معلومة

ما هو الجين (الجينات) الأول الذي تم العثور عليه لتشفير ncRNA

ما هو الجين (الجينات) الأول الذي تم العثور عليه لتشفير ncRNA



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لم أتمكن من العثور على مصدر يوضح ما الذي وجده الجين الأول لشفرة ncRNA. أخبرني أحدهم ، مع ذلك ، أنه جين مشفر إما لـ rRNA أو tRNA. حتى هذه اللحظة لم يكن لدي أي تأكيد آخر على صحة ذلك.


كانت أول جينات حقيقية النواة مستنسخة هي جينات الرنا 18S و 28S من الضفدع X. laevis كما هو موضح هنا: http://www.genome.gov/25520303

ونعم ، إنها بالتأكيد جينات ncRNA.


يعد التنظيم الجيني المتوازن بواسطة ncRNA للدماغ الجنيني أمرًا بالغ الأهمية لدائرة GABA الحصينية البالغة

توضح الدراسات الجينومية أنه على الرغم من نسخ غالبية جينوم الثدييات ، فإن حوالي 2 ٪ فقط من هذه النسخ هي رمز للبروتينات. لقد حققنا في طول مدة المعالجة بالعديد من الأدينيلات Evf2 ينظم الحمض النووي الريبي غير المشفر نسخ عوامل النسخ المثلية DLX5 و DLX6 في الدماغ الأمامي للفأر النامي. وجدنا أنه في تطوير الدماغ الأمامي البطني ، Evf2 قام بتجنيد عوامل النسخ DLX و MECP2 لعناصر تنظيمية مهمة للحمض النووي في دي إل إكس 5/6 منطقة بين الجينات والرقابة dlx5, دلكس 6 و جاد 1 من خلال التعبير عبر و رابطة الدول المستقلة- آليات التصرف. Evf2 خفضت طفرات الفئران أعداد الخلايا العصبية الداخلية GABAergic في الحصين والتلفيف المسنن بعد الولادة. على الرغم من أن أعداد interneurons GABAergic و جاد 1 عادت مستويات الحمض النووي الريبي إلى طبيعتها في Evf2 حصين بالغ متحولة ، حدث تثبيط متشابك منخفض. تشير هذه النتائج إلى أن التنظيم الجيني المتوازن غير المعتمد على الحمض النووي الريبي في الدماغ الجنيني أمر بالغ الأهمية للتكوين السليم للدوائر العصبية المعتمدة على GABA في دماغ البالغين.


الملخص

تنتج جينات RNA غير المشفرة (ncRNA) جزيئات RNA وظيفية بدلاً من البروتينات المشفرة. ومع ذلك ، تفترض جميع وسائل تحديد الجينات تقريبًا أن الجينات تشفر البروتينات ، لذلك حتى في عصر تسلسل الجينوم الكامل ، كانت جينات ncRNA غير مرئية بشكل فعال. في الآونة الأخيرة ، حددت عدة شاشات منهجية مختلفة عددًا كبيرًا بشكل مدهش من جينات ncRNA الجديدة. يبدو أن الحمض النووي الريبي غير المشفر متوفر بكثرة بشكل خاص في الأدوار التي تتطلب تمييزًا عاليًا للحمض النووي دون تحفيز معقد ، مثل توجيه التنظيم اللاحق للنسخ للتعبير الجيني أو في توجيه تعديلات الحمض النووي الريبي.


النتائج

يتم التحكم في إنتاج ERC بواسطة العديد من منظمات الكروماتين

إن مشاركة الكروماتين في التحكم في كل من النسخ الريبوزومي للـ ncRNAs وإعادة تركيب الحمض النووي الريبي (rDNA) واضح بشكل خاص في sir2Δ متحولة. تُظهر هذه السلالة فقدان النمط الظاهري لإسكات مع تراكم ncRNA (Bryk وآخرون. ، 1997 لي وآخرون، 2006). علاوة على ذلك ، فإن تكراراتها الريبوزومية غير مستقرة للغاية ، مع أحداث إعادة التركيب داخل الكروماتيد المتكررة التي تولد ERCs (Gottlieb and Esposito 1989 Kaeberlein وآخرون، 1999). تراكم ERCs في sir2Δ الخلايا هي أحد أسباب تقصير عمرها (Kaeberlein وآخرون، 1999). بالنظر إلى أن Sir2p عبارة عن هيستون ديستيلاز (Imai وآخرون. ، 2000 سوكا وآخرون. ، 2002) وأن الكروماتين الخاص بالطفرات يمكن الوصول إليه بشكل مفرط (Fritze وآخرون. ، 1997 Cioci وآخرون، 2002) ، حاولنا توضيح دور أستلة الهيستون وهيكل الكروماتين في إعادة التركيب ، من حيث تكوين ERCs ، وفي نسخ ncRNA. لإنجاز هذه المهمة ، أجرينا فحصًا متحيزًا ، بدءًا من قياس ERCs على طفرات الكروماتين المحددة (الشكل 2).

الشكل 2: منظمات الكروماتين تتحكم في تكوين ERC. (أ) التحليل الجنوبي لأنواع ERC. تم عزل الحمض النووي من سلالات الخميرة المحددة أو بعد 16 ساعة من العلاج بـ 500 ميكرومتر NAM ، وتم فحصها باستخدام تسلسل rDNA المشع. يشار إلى ERCs بواسطة الأسهم. ترجع الاختلافات في هجرة النطاقات المقابلة لـ ERCs إلى فترات مختلفة من الهجرة الكهربي. (ب) التحديد الكمي لمبلغ ERC. تم الإبلاغ عن المتوسطات و SD لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. ثنائي الذيل ر تم تطبيق الاختبار للتحليل الإحصائي. تشير العلامات النجمية إلى فروق ذات صلة إحصائية α = 0.05. قيم p هي كما يلي: سيدي 2، ص = 0.0419 NAM، ص = 0.0086 rpd3، ص = 0.0454 hst1، ص = 0.1388 hst2، ص = 0.6499 hst3، ص = 0.0083 hst4، ص = 0.1529 nhp6ab، ص = 0.0474.

ال HST1-4 رمز الجينات لـ NAD + - décetylases هيستون المعتمدة ، والتي تشترك في هوية تسلسل مهمة مع SIR2 الجين (Brachmann وآخرون. ، 1995) ، مما أدى إلى ظهور S. cerevisiae عائلة sirtuin. قمنا بقياس ERCs على طفرات مفردة من SIR2 و HST1-4 الجينات وعلى لوحة من السلالات الأخرى على النحو التالي. أولاً ، قمنا بالتحليل WT عولجت الخلايا بـ 500 ميكرومتر نيكوتيناميد (NAM) ، وهو مثبط غير تنافسي سيرتوين يزيد من إعادة تركيب الحمض النووي الريبي ويقصر العمر التكراري (بيترمان) وآخرون. ، 2002). ثانيًا ، قمنا بتوسيع الدراسة لتشمل المتحولة في Zn + -ddddd3d deacetylase ، Rpd3p ، لا علاقة لها بـ sirtuins. هذا الإنزيم يعادي Sir2p في إنشاء كروماتين صامت في التيلوميرات ومواقع HM و rDNA (سميث وآخرون.، 1999 Sun and Hampsey، 1999 Zhou وآخرون. ، 2009 ايرنتراوت وآخرون. ، 2010) ، وطفرة في RPD3 الجين يقلل من مستوى إعادة التركيب الجيني (Dora وآخرون، 1999). أخيرًا ، قمنا بالتحقيق في تورط مجموعة البروتينات Nhp6p عالية الحركة ، وهي عوامل معمارية للكروماتين (ستيلمان ، 2010). الطفرة المزدوجة NHP6A و NHP6B تؤدي الجينات إلى انخفاض كمية الهستونات ، مما يحدد فرط الوصول إلى الكروماتين (Celona وآخرون. ، 2011) وتراكم ERC ، مع ما يترتب على ذلك من عمر تقصير (Giavara وآخرون., 2005).

لقياس ERCs ، أخضعنا الحمض النووي الجينومي الكامل المنقى من الثقافات النامية لوغاريتميًا إلى الرحلان الكهربائي ونقلناه إلى مرشح النيتروسليلوز عن طريق النشاف الجنوبي. تم الكشف عن أنواع ERC على أنها نطاقات سريعة الهجرة بعد التهجين باستخدام مسبار ذو علامات إشعاعية (الأسهم في الشكل 2 أ). تم الإبلاغ عن التحديد الكمي لـ ERCs ، التي تم الحصول عليها عن طريق تطبيع مستوى ERC إلى كمية الجينوم المحملة لكل سلالة ، في الشكل 2B. توضح الرسوم البيانية مقدار ERCs لكل سلالة ، أو علاج ، بالنسبة إلى WT متساوي المنشأ أو العينة غير المعالجة ، والمشار إليها على أنها 1. تسمح البيانات المقدمة في هذا النموذج بإجراء تقييم مباشر لتغيرات الطيات في الخلفيات الجينية المختلفة.

ال sir2Δ تُظهر السلالة زيادة في مستويات ERC ، كما هو موضح سابقًا (Kaeberlein وآخرون، 1999). بالإضافة إلى ذلك ، ينتج عن علاج NAM لخلايا WT تراكم ERC ، مما يدل على أن النشاط التحفيزي sirtuin ضروري لقمع إعادة التركيب في rDNA. تم الإبلاغ عن هذه النتيجة مسبقًا عن طريق قياس معدل فقدان جينات العلامة المدمجة في rDNA (Bitterman وآخرون. ، 2002). هنا نؤكد البيانات الخاصة بإعادة التركيب داخل الكروماتيد ، مما يؤدي إلى إنتاج ERC.

على العكس من ذلك ، لاحظنا الغياب التام تقريبًا لـ ERCs في الخلايا التي تفتقر إلى هيستون ديسيتيلاز Rpd3p. بعيد مثل ال HST1-4 نحن قلقون ، لاحظنا زيادة كبيرة في كمية ERC في hst3 متحولة ، في حين أن مدى تكوين ERC لم يتأثر بالآخر hst حذف الجينات. وأخيرا، فإن nhp6ab الطفرة المزدوجة تعزز إعادة التركيب في rDNA ، كما هو متوقع (Giavara وآخرون., 2005).

مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن إعادة تركيب الحمض النووي الريبي يتم تثبيته بواسطة HST3 و NHP6AB النشاط الجيني ، إلى جانب نشاط المعروف SIR2. علاوة على ذلك ، يبدو أن نشاط نزع الأسيتيل العالمي على حساب Rpd3p مرتبط بإنتاج ERC.

يتوافق إنتاج ERC المتغير مع التغييرات في نسخ ncRNA

أشارت الدراسات السابقة إلى أن تخليق ncRNAs في rDNA بوساطة RNA polymerase II مرتبط بعدم استقرار مجموعة الريبوسوم. يشير النموذج الأكثر قبولًا إلى أن تنظيم إعادة التركيب بين الوحدات المتكررة للكتلة الريبوسومية يتحقق من خلال نسخ الحمض النووي الريبي النووي (كوباياشي وجانلي ، 2005).

لإظهار ما إذا كان يتم تحفيز تراكم ERC عن طريق نسخ ncRNA في طفراتنا ، قمنا بتحليل ncRNA الريبوسومي الناتج من المروج ثنائي الاتجاه E-PRO (الشكل 3 أ). في الواقع ، يشارك نشاط E-PRO بشكل مباشر في إعادة تركيب الحمض النووي الريبي ، والذي يتم إلغاؤه عند حذف E-PRO أو استبداله بمروج أحادي الاتجاه (كوباياشي وجانلي ، 2005). تم قياس مستوى NTS1-R ncRNA (الشكل 3 أ) عن طريق النسخ العكسي- PCR (RT-PCR) ، باستخدام التمهيدي الخاص بحبلا. تكافؤ PCR مع زوج oligo لـ قانون 1 من أجل تطبيع البيانات. يوضح الشكل 3 ب مستوى ncRNA لكل متحولة وحالة ، معبراً عنها بنسبة نسبة إلى WT متساوي المنشأ أو العينة غير المعالجة ، على التوالي.

الشكل 3: يتم تحفيز تكوين ERC عن طريق نسخ ncRNA. (أ) خريطة تخطيطية لوحدة rDNA. أسهم سوداء أفقية رفيعة ، ncRNAs تم إنتاجها من مروجي E-PRO و C-PRO. السهم الأبيض الأفقي ، oligo NTS1-R المستخدم في RT-PCR الخاص بالحبلا. (ب) القياس الكمي لمستوى التعبير ncRNA. تشير الرسوم البيانية إلى المتوسطات و SDs من ثلاث تجارب مستقلة. ثنائي الذيل ر- تم تطبيق الاختبار للتحليل الإحصائي. تشير العلامات النجمية إلى فروق ذات صلة إحصائية α = 0.05. قيم p هي كما يلي: سيدي 2، ص = 0.0006 NAM، ص = 0.002 rpd3، ص = 0.0013 hst1، ص = 0.0703 hst2، ص = 0.1451 hst3، ص = 0.0047 hst4، ص = 0.125 nhp6ab، ص = 0.0454.

SIR2 يؤدي الحذف إلى زيادة مضاعفة في تعبير ncRNA ، كما ورد سابقًا (Li وآخرون، 2006). بالإضافة إلى ذلك ، يتسبب علاج NAM في زيادة تنظيم ncRNA ، على الرغم من أن التأثير أقل وضوحًا مما هو عليه في sir2Δ متحولة. ال rpd3 تُظهر سلالة متحولة انخفاضًا كبيرًا في مستويات ncRNA ، بما يتوافق مع الدور الواضح لهذا هيستون ديسيتيلاز في مواجهة إسكات نسخ الحمض النووي الريبي (سميث). وآخرون. ، 1999 صن وهامبسي ، 1999). ال hst3 متحولة تتراكم ncRNA. على العكس تماما hst1Δ, hst2Δ، و hst4Δ تظهر السلالات اختلافات طفيفة فقط في إنتاج نسخة ncRNA هذه. علاوة على ذلك ، فإن نسخ Pol II من rDNA في nhp6ab المتحولة المزدوجة أعلى بثلاثة أضعاف من WT متساوي المنشأ ، مما يوفر أول دليل على تورط بروتينات المجموعة عالية الحركة في تنظيم إنتاج ncRNA.

من المثير للاهتمام ، لاحظنا وجود مراسلات قوية بين إنتاج ERC (الشكل 2) وملفات تعريف التعبير ncRNA (الشكل 3) في المسوخ الكروماتين الذي تم تحليله. في الواقع ، المسوخات التي تنتج المزيد من ERC (سيدي 2, hst3، و nhp6ab) تظهر أيضًا مستويات مرتفعة من نسخ ncRNA. من ناحية أخرى ، في rpd3 تم قمع إعادة التركيب المتحولة ، rDNA جزئيًا وانخفض تعبير ncRNA بشكل كبير.

في المسوخات التي تمت دراستها ، تتوافق البيانات مع النموذج الذي يتم بموجبه تحفيز إنتاج ERC عن طريق نسخ الحمض النووي الريبي (Kobayashi and Ganley ، 2005).

ترتبط أستلة هيستون H4 بإنتاج ERC و ncRNA

تشير البيانات السابقة إلى وجود تأثير قوي لمنظمات الكروماتين (هيستون ديسيتيلز والعوامل المعمارية للكروماتين) على التحكم في إعادة تركيب الحمض النووي الريبي (rDNA) بوساطة نسخ ncRNA. تبين أن هذه العملية الأخيرة مرتبطة بالتغيرات في نمط أستيل هيستون في rDNA (Cesarini وآخرون., 2010).

للكشف عن العلاقة بين أستلة هيستون وإعادة التركيب الناجم عن النسخ في rDNA ، قمنا بتحليل مستوى الأستلة العالمي لهستون H4 في جميع سلالاتنا. في الواقع ، تعد حالة الأسيتيل في اللايسينات داخل الطرف N لهذا الهيستون أمرًا بالغ الأهمية للتحكم في إسكات التيلوميرات ومواقع HM و rDNA (Hecht وآخرون. ، 1995 براونشتاين وآخرون. ، 1996 Imai وآخرون. ، 2000 هوبي وآخرون. ، 2002 تشو وآخرون., 2009).

قمنا بتقييم أسيتيل هيستون H4 من خلال نهج الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) (Rundlett وآخرون. ، 1998). تم تحصين مستخلصات الكروماتين بالأجسام المضادة ضد المنطقة الطرفية C من هيستون H4 أو شكل الأسيتيل N-terminal (في ليسين 5 و 8 و 12 و 16). تم تحليل الحمض النووي المناعي بواسطة PCR باستخدام بادئات محددة لستة مناطق مختلفة من الحمض النووي الريبي: تسلسل الترميز 35S (COD) ، ومُحسِّن النسخ Pol I المفترض (ENH) ، ومروجو E-PRO و C-PRO ، وهي منطقة ذات نيوكليوسومات عالية الموضع (NUC) ، وتسلسل ARS (تفاصيل الخريطة في الشكلين 1 و 4 أ). معتبرا أن SIR2 تؤثر الطفرات على إجمالي إشغال هيستون H3 في rDNA (Li وآخرون، 2006) وأن nhp6ab متحولة تظهر انخفاضًا على مستوى الجينوم في الجسيمات النووية (Celona وآخرون. ، 2011) ، قررنا تطبيع أستلة هيستون H4 إلى كمية H4 بأكملها في جميع السلالات. بالإضافة إلى ذلك ، في الرسوم البيانية ، يتم الإبلاغ عن البيانات المتعلقة بمستوى الأسيتيل من النوع البري (الخط الأزرق ، الشكل 4 ب).

الشكل 4: يتم تغيير ملف تعريف أسيتيل H4 في الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي) من هيستون ديستيلاسيس وطفرات بروتينات المجموعة عالية الحركة. (أ) تمثيل رسومي لوحدة rDNA. تشير الخطوط السوداء السميكة الأفقية إلى مواضع أمبليكونات PCR الناتجة عن تجارب ChIP (وليس القياس). (ب) تحليل ChIP لملف تعريف أستيل هيستون H4 في rDNA. تم ترسيب الكروماتين من السلالات المحددة بأجسام مضادة ضد الذيل الطرفي C لهستون H4 (H4 C-TERM) أو ضد هيستون H4 أسيتيل في ليسين 5 و 8 و 12 و 16 (ACH4). توضح الرسوم البيانية إثراء الأسيتيل ، في مناطق الحمض النووي الريبي المشار إليها ، للطفرات المتعلقة بسلالة WT متساوية المنشأ ، والتي تم الإبلاغ عنها على أنها 1 (خط أزرق). تُظهر الخطوط متوسط ​​النسب و SD للتكرارات التقنية في تجربة تمثيلية من بين اثنين تم إجراؤها.

عندما sir2Δ تمت مقارنة السلالة مع WT ، لوحظت زيادة قوية في أستلة هيستون H4 في جميع أنحاء الفاصل غير المكتوب ، مما يؤكد الملاحظات السابقة (Bryk وآخرون. ، 2002 Cioci وآخرون. ، 2002). تم الحصول على نتائج مماثلة بعد تثبيط النشاط التحفيزي للسرتوين بواسطة NAM. ومع ذلك ، يزيد NAM أستلة هيستون بدرجة أقل مما يفعل SIR2 حذف.

بشكل غير متوقع ، ينتج عن طفرة هيستون ديسيتيلاز Rpd3p انخفاض كبير في مستوى أسيتيل H4 في rDNA. تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة ل rpd3 المسوخ في التيلوميرات على وجه التحديد ، هذا صحيح بالنسبة لـ H4K12 في الخميرة (Ehrentraut وآخرون. ، 2010) ولعدة مخلفات H4 ليسين في ذبابة الفاكهة (بورغيو وآخرون. ، 2011). تمثل ملاحظتنا أول دليل على نقص الأسيتيل في rDNA لـ rpd3 المسوخ.

ثم قمنا بتحليل مستوى أسيتيل H4 بشكل عام hst1-4 المسوخ. لقد وجدنا أن hst3 و hst4 تُظهر السلالات ، في المتوسط ​​، زيادة بمقدار 1.5 ضعف في أستلة H4 في جميع المناطق التي تم تحليلها (الشكل 4) ، على الرغم من أن نشاط نزع الأسيتيل لهذه البروتينات قد تم الإبلاغ عنه فقط في هيستون H3 ليسين 56 (Xu وآخرون. ، 2007 يانغ وآخرون، 2008). ل hst1 و hst2 المسوخات لم نتمكن من اكتشاف أي تباين كبير بالنسبة لسلالة WT متساوية المنشأ (بيانات غير منشورة).

إن زيادة أستلة هيستون H4 في NTS واضحة أيضًا بالنسبة للسلالات الطافرة التي تفتقر إلى NHP6A و NHP6B الجينات ، مما يشير إلى سوء التنظيم في توازن الأستلة / نزع الأسيتيل في طفرات بروتينات المجموعة عالية الحركة.

للتحقق مما إذا كان التغيير في أستلة هيستون يتضمن مناطق أخرى صامتة ، قمنا بتوسيع تحليل ChIP ليشمل تيلومير الذراع الأيمن للكروموسوم السادس (الشكل التكميلي S1B). وجدنا تغييرات في أنماط الأسيتيل ل sir2Δ, rpd3Δ، والخلايا المعالجة بـ NAM ، على غرار ما يحدث في rDNA. على العكس من ذلك ، في hst3 و nhp6ab المسوخ ، لم يلاحظ أي تغيير في مستوى أستلة هيستون H4 في التيلوميرات ، مما يشير إلى أن تأثيرها على أسيتيل H4 يقتصر على موضع الريبوسوم (الشكل التكميلي S1B).

اللافت للنظر أن البيانات الواردة في الأشكال 2-4 تظهر ارتباطًا واضحًا بين إنتاج ERC ، ونسخ ncRNA ، واستلة هيستون H4 بين السلالات التي تم تحليلها. في الواقع ، تُظهر المسوخات ذات التعديلات في مستويات ERC و ncRNA أيضًا تغييرًا مناظرًا في أستلة هيستون H4. ومع ذلك ، فإن التحليلات التي تم إجراؤها حتى الآن لا تسمح لنا بالتمييز بين بقايا اللايسين التي تفسر الاختلافات الملحوظة ، بسبب خصوصية التعرف المتعددة (ليسين 5 ، 8 ، 12 ، 16) للجسم المضاد المستخدم في اختبار ChIP.

يتداخل الأسيتيل H4K16 مع الأستلة العالمية H4 في طفرات الكروماتين

قررنا بعد ذلك قياس مستوى الأسيتيل لبقايا H4K16 في جميع الطفرات للأسباب التالية: 1) تم العثور على أسيتيل H4K16 ليكون مرتبطًا بنسخ Pol II في مناطق متكافئة اللون في جميع حقيقيات النوى (Millar) وآخرون. ، 2006) 2) يعتبر نزع الأسيتيل ضروريًا لإسكات النسخ في جميع المواقع الصامتة الثلاثة في الخميرة (Hecht وآخرون. ، 1995 براونشتاين وآخرون. ، 1996 هوبي وآخرون. ، 2002) و 3) H4K16 هو الهدف الرئيسي لنزع السلاح من Sir2p ، وسيط الإسكات (Imai وآخرون، 2000). بالنظر إلى التغييرات في نسخ ncRNA في المسوخ المدروسة ، فمن المتصور أن acetylation من هذه البقايا يلعب دورًا في تعديلات عملية الإسكات في rDNA.

عندما تم تحصين مستخلصات ChIP بالأجسام المضادة ضد الشكل الأسيتيل لـ H4K16 (H4K16-ac) ، كانت النتيجة الإجمالية ، التي تم الحصول عليها بعد التطبيع إلى إجمالي كمية هيستون H4 ، مماثلة لتلك الموضحة في شكل الأسيتيل عالميًا لـ H4 (الشكل 5 أيضًا انظر ACH4 الواردة في الشكل 4).

الشكل 5: التعديلات في أسيتيل H4 Lys-16 ترتبط بالتغيرات الملحوظة في أستلة H4 العالمية. (أ) خريطة تخطيطية لتكرار rDNA. يتم عرض الأجزاء التي تم تضخيمها في تحليلات ChIP. (ب) تحليل رقاقة من هيستون H4 Lys-16 أستلة في rDNA. كما في الشكل 4 ب ، باستثناء أن الأجسام المضادة المستخدمة كانت ضد الذيل الطرفي C لهستون H4 (H4 C-TERM) أو ضد H4 الأسيتيل في Lys-16 (H4K16-ac).

من خلال مقارنة ملفات تعريف acetylation لـ سيدي 2 متحولة ، تم الحصول عليها باستخدام الأجسام المضادة αH4K16-ac و αACH4 ، لاحظنا أن أستلة H4K16 يزيد بدرجة أقل. من المحتمل أن يكون هذا بسبب حقيقة أن H4K16 ليس البقايا الوحيدة التي تزداد أستيلها في سيدي 2 متحولة (براونشتاين وآخرون. ، 1996). يبدو أن معاملة NAM تثبط بكفاءة مختلفة H4K16-ac و ACH4. في الواقع ، تُظهر الخلايا المعالجة بـ NAM نفس مدى أستلة H4K16 مثل sir2∆ سلالة ، في حين أن هذا ليس واضحًا بالنسبة لأستلة H4 العالمية.

وفقًا للنتائج السابقة (الشكل 4) ، فإن rpd3 المسوخ انخفاضًا حادًا في أستلة H4K16 في جميع مناطق rDNA التي تمت دراستها. أستلة من hst3 و hst4 يبدو أن الطفرات تتأثر قليلاً ، في حين أن تأثير nhp6 الطفرة ، مرة أخرى ، أعلى. علاوة على ذلك ، يبدو أن Hst3p و Hst4p و Nhp6p يؤثران على أسيتيل H4K16 على وجه التحديد في rDNA ، كما تؤكده حقيقة أن مدى الأستلة لمنطقة فرعية من التيلومير السادس لا يتم تغييره في سلالات متحولة (الشكل التكميلي S1C).

نظرًا لأنه من المعروف أن Hst3p و Hst4p deacetylases يعملان على H3K56 و Rpd3p خاص بـ H4K12 (من بين اللايسينات الأخرى) ، قمنا بتقييم مدى الأستلة لهذه المخلفات (الشكل التكميلي S2). وجدنا انخفاضًا طفيفًا في H4K12-ac وزيادة طفيفة في H3K56-ac في rDNA لـ rpd3 و hst3 المسوخ ، على التوالي. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة عندما تم تمديد التحليل إلى التيلوميرات لهذه السلالات (الشكل التكميلي S2).

مجتمعة ، تسلط البيانات الضوء على تراكم أسيتيل H4K16 انتقائي واضح (الشكل 5) في موضع الريبوسوم في تلك المسوخات حيث يتم زيادة كميات كل من ncRNA و ERC (سيدي 2, nhp6abوجزئيا hst3). في المقابل ، في rpd3 يبدو أن نقص الأسيتيل المتحولة لـ H4K16 مرتبط بانخفاض في إنتاج كل من ERC و ncRNA (الأشكال 2 و 3 و 5).

تتحكم أسيتيل H4K16 في تراكم ERC ونسخ ncRNA

لإسناد دور لأسيتيل H4K16 بشكل لا لبس فيه كمنظم رئيسي لإعادة التركيب ونسخ Pol II في rDNA ، استخدمنا سلالات الخميرة التي تحمل بدائل H4K16 للأرجينين (H4K16R) أو الجلوتامين (H4K16Q). يحاكي هذان التعديلين حالة البقايا غير المسبوقة أو المؤستلة ، على التوالي. H4K16R و H4K16Q سبق أن أظهرت الطفرات أنها تغير من إسكات الخميرة (Hecht وآخرون.، 1995 Meijsing and Ehrenhofer-Murray، 2001 Hoppe وآخرون., 2002).

في الشكل 6 ، نُبلغ عن نتائج إعادة تركيب الحمض النووي ، مقاسة كتراكم ERC (الشكل 6 أ) ، ونسخ بول الثاني ، المقاس كإنتاج ncRNA (الشكل 6 ب). H4K16Q, H4K16R، وسلالات WT متساوية المنشأ الخاصة بهم إلى المرحلة الأسية وأنواع ERC التي تم تحليلها كما هو موضح في الشكل 2. H4K16Q تُظهر السلالة زيادة مضاعفة في محتوى ERC بالنسبة إلى WT متساوي المنشأ. في المقابل ، فإن H4K16R تحافظ الطفرة على مقدار ERC على مستوى WT (الشكل 6 أ).

الشكل 6: نزع الأسيتيل لـ H4K16 مطلوب لقمع تكوين ERC ونسخ ncRNA. (أ) استبدال هيستون H4 Lys-16 بالجلوتامين يزيد من إنتاج ERC. التحديد الكمي لكمية ERC التي تنتجها سلالات الخميرة التي تحمل بدائل H4K16 للجلوتامين ، H4K16Q (يسار) أو أرجينين ، H4K16R (حق). تم تحديد كمية أنواع ERC وتطبيعها كما هو موضح في الشكل 2 (n & gt 3 ± SD). ثنائي الذيل ر تم تطبيق الاختبار للتحليل الإحصائي. تشير النجمة إلى الفرق ذي الصلة إحصائيًا ، α = 0.05 ، بين WT (PKY501) و H4K16Q (ع = 0.0204) سلالات. (ب) إن H4K16Q متحولة ينظم النسخ ncRNA في rDNA. قياس مستوى التعبير ncRNA المشتق من E-PRO لـ H4K16Q (اليسار)، H4K16R (يمين) ، و WT المناظرة كما في الشكل 3 (ن = 3 ± SD). تشير النجمة إلى الفرق ذي الصلة إحصائيًا ، α = 0.05 ، بين WT (PKY501) و H4K16Q (ع = 0.0264) سلالات.

قمنا بعد ذلك بقياس مستوى تعبير ncRNA ، المشتق من محفز E-PRO ، كما في الشكل 3. يوضح الشكل 6B كيف ، حتى في هذه الحالة ، H4K16Q تؤدي الطفرة إلى فقدان الإسكات في rDNA ، مع زيادة مستوى الحالة المستقرة لـ ncRNA ، في حين أن H4K16R يبدو أن السلالة تنتج ncRNA بمعدل مماثل لـ WT.

بشكل عام ، تشير هذه البيانات إلى أن استبدال بقايا اللايسين المشحونة إيجابياً 16 بمخلفات محايدة كافٍ للحث على تحرير منسق لكل من نسخ ncRNA وإعادة التركيب ، مما يشير إلى دور محوري لأسيتيل H4K16 للتحكم في TAR في rDNA.

ال nhp6ab طفرة تؤثر على تعبير SIR2

تظهر النتائج التي تم الإبلاغ عنها هنا أن أسيتيل H4 Lys-16 كافٍ للتحكم في TAR في rDNA ، لأنه في H4K16Q المسوخ كلا العمليتين تتأثر. بالإضافة إلى ذلك ، في سيدي 2, rpd3, hst3، و nhp6ab سلالات متحولة لوحظ وجود علاقة واضحة بين حالة أستيل H4K16 وتنظيم إعادة التركيب بواسطة ncRNA.

التفسير المباشر للآلية الكامنة وراء هذه الأنماط الظاهرية ممكن فقط لـ sir2Δ سلالة ، لأن Sir2p فقط يزيل الأسيتيل H4K16 في المختبر وفي الجسم الحي. قد يكون التفسير المحتمل للاختلافات الملحوظة في أستيل H4K16 في المسوخات الأخرى هو التوظيف المعيب لـ Sir2p في مجموعة الريبوسومات.

اختبرنا هذه الفرضية عن طريق قياس ارتباط Sir2p في rDNA بواسطة تحليل ChIP. مقتطفات من الكروماتين rpd3, hst3، و nhp6ab تم ترسيب المسوخات بأجسام مضادة لـ αSir2 ، وتم تضخيم الحمض النووي في منطقتين ، ENH و C-PRO ، وقد ثبت سابقًا أنهما مرتبطان على وجه التحديد بـ Sir2p (Huang and Moazed ، 2003). وجدنا أن تخصيب Sir2p في rDNA لـ nhp6ab قطرات متحولة نسبة إلى وزن متساوي المنشأ (الشكل 7 أ). بالمقابل rpd3 و hst3 لم تظهر المسوخات تغييرات كبيرة في مستوى توظيف Sir2p (الشكل التكميلي S3). لاحظ الانخفاض في nhp6ab سلالة تشمل كلا المنطقتين إلى حد مماثل جدا.

الشكل 7: إن nhp6ab طافرة قد انخفض SIR2 التعبير. (أ) إن nhp6ab يؤدي متحولة مزدوجة إلى فقدان Sir2p من موضع rDNA. WT و nhp6ab تم إخضاع سلالات لتحليل ChIP بأجسام مضادة ضد Sir2p. تم تضخيم الحمض النووي المستعاد في منطقتين معروفتين بربطهما بـ Sir2p - المحسن (ENH) ومحفز C-PRO. (ب) يتم تقليل تعبير Sir2 mRNA بتنسيق nhp6ab الخلايا. يوضح الرسم البياني مستويات Sir2 mRNA لـ nhp6ab وسلالات WT المقاسة بواسطة RT-PCR (ن = 3 ± SD). (ج) إن nhp6ab تحتوي الخلايا الطافرة على مستوى بروتين Sir2 منخفض. مستخلصات البروتين من ثلاث مزارع خلوية مستقلة من WT (يسار) أو nhp6ab تم تحليل الخلايا (اليمنى) بواسطة لطخة غربية مع مضادات Sir2 والأجسام المضادة لـ α-tubulin.

افترضنا أن الانخفاض النسبي في ربط Sir2p في C-PRO و ENH يمكن أن يعكس انخفاضًا عامًا في توفر Sir2p في nhp6ab المسوخ. للتحقق من هذه الفرضية ، قمنا بقياس تعبير SIR2 mRNA ومستوى البروتين بواسطة RT-PCR و Western blot (الشكل 7). مقارنةً بـ WT ، يُظهر المسوخ انخفاضًا مضاعفًا في مستويات SIR2 mRNA (الشكل 7B) ، كما أن كمية بروتين Sir2 أقل (الشكل 7C).

للتحقق مما إذا كانت آثار nhp6ab تقتصر الطفرة على موضع الريبوسوم ، وقمنا أيضًا بقياس تجنيد Sir2p في telomere VI R. وجدنا انخفاضًا طفيفًا في ربط Sir2p عند التيلومير (الشكل التكميلي S4A). في الواقع ، إسكات التيلومير nhp6ab لا يتأثر ، مما يشير إلى أن الانخفاض الملحوظ ليس مؤثرًا (الشكل التكميلي S4B).

SIR2 يعيد الإفراط في التعبير معظم أنماط WT في nhp6ab متحولة

الزيادة في نسخ ncRNA وتراكم ERC و H4 hyperacetylation في nhp6ab متحولة يمكن تفسيرها جميعًا من خلال الانخفاض الملحوظ في SIR2 منتج الجين (الشكل 7). إذا كان هذا هو الحال ، فإن التعبير خارج الرحم عن SIR2 يجب أن يستعيد الجين إسكات rDNA ، والتحكم في إعادة التركيب ، ومستوى WT للأستلة في nhp6ab أضنى.

هكذا تحولنا nhp6ab وخلايا WT مع البلازميد pAR44 ، حيث SIR2 تحت سيطرة مروج GAL10 (هولمز وآخرون. ، 1997). تمت مقارنة هذه المحولات بالخلايا التي تم تحويلها باستخدام ناقل فارغ لإنتاج ncRNA (الشكل 8 أ) ، وأسيتيل هيستون H4 (الشكل 8 ، B و C) ، وتشكيل ERC (الشكل 8 د). نمت جميع السلالات في الجالاكتوز للحث SIR2 التعبير.

الشكل 8: SIR2 يعيد التعبير المفرط مستوى WT لنسخ ncRNA و H4 acetylation في nhp6ab متحولة. (أ) SIR2 الإفراط في التعبير nhp6ab متحولة يعيد مستويات النسخ ncRNA. WT و nhp6ab تم تحويل الخلايا بالبلازميد pAR44 (+) أو بالناقل الفارغ (-). تم إجراء التحديد الكمي للتعبير عن ncRNA كما هو موضح في الشكل 3 (ن ≥ 4 ± SD). ثنائي الذيل ر تم تطبيق الاختبار للتحليل الإحصائي. تشير العلامات النجمية إلى الفروق ذات الصلة إحصائيًا بين nhp6ab خلايا مع أو بدون SIR2 الإفراط في التعبير (α = 0.01 p = 0.0015) أو بين خلايا WT مع أو بدون SIR2 الإفراط في التعبير (α = 0.01 ع = 0.009). (ب) SIR2 ينقذ الإفراط في التعبير أستيل هيستون H4 المتغير من nhp6ab متحولة. زيادة التعبير عن الخلايا (+) أم لا (-) SIR2 ، تمت زراعته في الجالاكتوز ومعالجته لتحليل ChIP بأجسام مضادة ضد الذيل C-terminal للهيستون H4 أو ضد هيستون الأسيتيل H4 (ACH4). تفاصيل القياس الكمي ومواقع شظايا PCR كما في الشكل 4. (C) زيادة أستيل H4K16 لـ nhp6ab ينخفض ​​إلى مستوى WT بعد SIR2 الإفراط في التعبير. كما هو الحال في B ، فيما عدا أن الأجسام المضادة كانت هيستيل هيستون H4-Lys-16 (H4K16-ac) ومضاد H4 C- الذيل الطرفي (H4 C-TERM). (د) SIR2 لا يقلل الإفراط في التعبير من مستويات ERC في nhp6ab أضنى. تم استخراج الحمض النووي من الخلايا التي تحتوي على PAR44 بلازميد (+) أو ناقل فارغ (-) ومعالجتها لتحليل ERC كما هو موضح في الشكل 2 (ن = 3 ± SD).

في هذه الحالة ، تم استخدام قيمة تعبير ncRNA لخلايا WT المحولة بالبلازميد الفارغ كعامل طبيعي وتم الإبلاغ عنها على أنها 1 في الرسم البياني في الشكل 8A. لاحظنا انخفاضًا كبيرًا في تعبير ncRNA لـ nhp6ab متحولة الإفراط في التعبير SIR2 بالمقارنة مع نفس السلالة دون التعبير خارج الرحم SIR2. تُظهر خلايا WT التي تم تحويلها ، كعنصر تحكم ، باستخدام pAR44 أيضًا انخفاضًا كبيرًا في ncRNA بالنسبة إلى سلالة WT المقابلة بدون SIR2 الإفراط في التعبير. تم إجراء تحليل موازٍ على الخلايا المزروعة في الوسط القمعي المحتوي على الجلوكوز. ومع ذلك ، بسبب تسرب مروج GAL10 (Lange وآخرون. 2000) ، تم الكشف عن تعبير SIR2 واضح ، واستعادة إسكات ncRNA في nhp6ab متحولة (بيانات غير منشورة).

تم تمديد تحليل إنقاذ النمط الظاهري إلى مستويات الأسيتيل H4 العالمية (ACH4) في مناطق rDNA المختلفة لنفس السلالات التي تمت دراستها مسبقًا (الشكل 8B). تم إجراء قياس أسيتيل H4 بواسطة ChIP ، كما ورد في الشكل 4. عندما تتم مقارنة خلايا WT المحتوية على pAR44 مع خلايا WT المحولة بالبلازميد الفارغ ، لوحظ ملف تعريف أستيل مماثل في معظم المناطق التي تم تحليلها. على العكس من ذلك ، يتضح انخفاض حاد في أسيتيل H4 في nhp6ab متحولة أن overexpresses SIR2 على صلة قربى ب nhp6ab خلايا بدون SIR2 تعبير خارج الرحم. في الواقع، SIR2 الإفراط في التعبير يجعل مستويات أسيتيل H4 متطابقة تقريبًا في WT و nhp6ab الخلايا.

قمنا أيضًا بتحليل الأسيتيل المحدد لهستون H4 في بقايا Lys-16 (H4K16-ac). ملفات تعريف acetylation (الشكل 8C) قابلة للمقارنة مع تلك التي لوحظت مع الأجسام المضادة αACH4. يوضح هذا أيضًا أن أسيتيل H4K16 يتداخل مع أستيل H4 العالمي في موضع الحمض النووي الريبي.

يُظهر تعبير ncRNA ومستويات أسيتيل H4 التي تم الحصول عليها من الثقافات التي تستخدم الجلوكوز كمصدر للكربون (الأشكال 3-5) ملامح متشابهة ، لكن قيمًا مطلقة مختلفة ، مقارنة بتلك التي لوحظت عندما تزرع الخلايا في الجالاكتوز (الشكل 8). بالنظر إلى أن Sir2p هو إنزيم معتمد على NAD + ، وبالنظر إلى دوره المحوري في هذه العمليات ، فمن الممكن تصور التغييرات بسبب التغيرات الأيضية.

كما تم تحليل نفس السلالات لإنتاج ERC (الشكل 8 د). ومع ذلك ، بالنسبة لهذا النمط الظاهري ، SIR2 لم يستعيد الإفراط في التعبير مستوى وزن إعادة التركيب.


النسخ ncRNA يجعل بصماته

تتضمن إحدى الإستراتيجيات المعترف بها مؤخرًا لتنظيم الجينات نسخ نسخة RNA غير مشفرة (ncRNA) تتداخل مع الجين المستهدف للتنظيم. في كثير من الحالات ، يبدو أن عملية النسخ نفسها وليس نسخة ncRNA هي التي تتوسط التنظيم. ورقة في هذا العدد من مجلة EMBO يُظهر إحدى الآليات التي تنظم بها أحداث النسخ هذه النسخ التي تطول بوليمرات الحمض النووي الريبي (RNA) وتوجه مجموعة من تعديلات الهيستون التنظيمية التي تعدل التعبير عن الجين المتداخل.

كانت المفاجأة الكبرى في السنوات القليلة الماضية هي اكتشاف نشاط نسخ كبير عبر جينومات حقيقية النواة بأكملها ، مما يُظهر فئة كبيرة من ncRNAs التي غالبًا ما تتحلل بسرعة (Yazgan and Krebs ، 2007). في عدد من الحالات ، تم العثور على هذه ncRNAs لتنظيم التعبير الجيني. تعمل معظم هذه ncRNAs التنظيمية من خلال مسارات RNA بوساطة من قمع الجينات. ومع ذلك ، فإن بعض ncRNAs تنظم التعبير الجيني في رابطة الدول المستقلة. في هذه الحالات ، يتوسط فعل النسخ نفسه ، بدلاً من منتج RNA للنسخ ، تنظيم الجين المتداخل.

الآليات المقترحة للتنظيم في رابطة الدول المستقلة بما في ذلك انسداد المروج أو التداخل النسخي بواسطة بوليميراز RNA الذي ينسخ ncRNAs (Yazgan and Krebs ، 2007). تُظهر الجينات الأخرى اختيار موقع بدء النسخ المنظم من مروج واحد ، مما يؤدي إلى إما نسخة تشفير أو ncRNA (Jenks وآخرون، 2008 Kuehner and Brow ، 2008). مروج خفي يقع في 3 نهاية PHO5 الجين ويقود نسخة مضادة المعنى مطلوبة للخواص الحركية الطبيعية لـ PHO5 التفعيل (Uhler وآخرون، 2007). نسخ سلسلة من ncRNAs المنبع من Schizosaccharomyces pombe fbp1 + المروج مطلوب لتحريضه عندما يتم تحويل الخلايا إلى ظروف محرضة (Hirota وآخرون، 2008). مرور RNA polymerase II عبر fbp1 + المروج أثناء نسخ هذه ncRNAs يعزز تكوين كروماتين مفتوح ، مما يسمح لعامل النسخ بالوصول إلى fbp1 + المروج أثناء الحث.

في الوقت الحاضر ، تقارير Houseley وآخرون (2008) وبواسطة بينسكايا وآخرون (2009) يقدم دليلًا مقنعًا على أن نسخ ncRNAs يؤثر على تعديلات ما بعد الترجمة للهيستونات التي تسهل قمع الجينات المتداخلة.

تجارب الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) التي أجراها Houseley وآخرون showed a surprising pattern of Set1-dependent histone H3K4 trimethylation across the well-characterized GAL1–10 gene locus (Figure 1). A significant peak of this histone methylation mark, normally associated with the 5′ end of transcribed genes, was found within the 3′ end of GAL10 when cells were grown in glucose medium (GAL1-10 repressing conditions). These observations led Houseley وآخرون to identify and characterize a set of ncRNAs that are transcribed from the 3′ end of GAL10 across the promoter region shared by the divergent GAL1 و GAL10 genes, which they named GAL10 ncRNAs.

Pinskaya وآخرون observed that cells lacking Set1 induced GAL1–10 expression more rapidly than wild-type cells when cells were shifted to galactose medium, although the final, fully induced levels of GAL mRNA were unchanged. The increased expression of GAL1–10 في set1 cells correlated with TBP occupancy at the GAL1–10 promoter, suggesting that Set1 regulates transcription initiation at GAL1–10. Furthermore, an H3K4A mutant showed a similar induction phenotype, indicating a role for H3K4 methylation in GAL1–10 induction. Subsequent experiments identified a set of ncRNA transcripts similar to those reported by Houseley وآخرون, which they named GAL1ucut (GAL1 upstream cryptic unstable transcripts).

Both groups mapped the GAL1ucut promoter to a location in the 3′ end of GAL10 near a pair of binding sites for the Reb1 transcription factor. Mutation of REB1, or of the Reb1 sites in GAL10, abolished GAL1ucut expression. Furthermore, both groups found an inverse relationship between GAL1ucut و GAL1–10 expression. GAL1ucut is expressed under conditions that repress GAL1–10, and as GAL1–10 is induced GAL1ucut declines. Curiously, Houseley وآخرون did not observe an effect of GAL1ucut تشغيل GAL1–10 expression when cells were shifted to a medium with high levels of galactose. Rather, they observed that GAL1ucut antagonized the induction kinetics and final levels of GAL1–10 in a medium with low levels of both glucose and galactose. The basis for the difference in observations between the groups is not obvious, but both agree that GAL1ucut is used to attenuate GAL1–10 expression.

Both groups argue that GAL1ucut acts in cis. First, Houseley وآخرون formed a heterozygous diploid yeast strain in which one of the two GAL1–10 loci lacked the GAL1ucut المروجين. They observed no attenuation of GAL1–10 expression in this strain. Second, both groups found that GAL1ucut RNA was stabilized by mutations affecting RNA degradation pathways used to target ncRNA, and Pinskaya وآخرون showed that this stabilization had no effect on GAL1–10 induction.

Earlier work has shown that Rpd3S histone-deacetylase complex is recruited to the body of protein-coding genes by H3K36-methylated nucleosomes ( Lee and Shilatifard, 2007 ). This serves to inhibit intragenic transcription from cryptic promoters that might otherwise be activated by the passage of transcription elongation complexes. Houseley وآخرون observed that histone modifications, which are the hallmarks of this Rpd3S-mediated intragenic repression mechanism, methylation of histone H3K36 and subsequent histone deacetylation, were found across the repressed GAL1–10 المكان. Furthermore, these marks were dependent on GAL1ucut transcription, and deletion of the Eaf3 subunit of the Rpd3S complex relieved glucose repression to a level similar to that observed when the GAL1ucut promoter was deleted.

Pinskaya وآخرون also found a role for Rpd3S in GAL1ucut function. As H3K4-methylated histones can be recognized by proteins with the PHD domain ( Mellor, 2006 ), Pinskaya وآخرون systematically tested yeast strains lacking different PHD proteins for an effect on GAL1–10 induction. They found that loss of Rco1, a component of the Rpd3S complex, mimicked the effects of set1 mutations on GAL1–10 expression. In addition, they used ChIP to show that Rpd3 is recruited to the repressed GAL1–10 locus and that this is abolished by H3K4A and set1 mutations. Interestingly, they did not observe any effect of a mutation deleting SET2, which encodes the H3K36 methyltransferase ( Lee and Shilatifard, 2007 ), on GAL1–10 induction kinetics, suggesting that the effects of GAL1ucut transcription might be mediated primarily through H3K4 methylation.

Although the different observations regarding the effects of GAL1ucut on induction kinetics and expression in low levels of glucose still need to be resolved, these papers indicate that cryptic transcription events might be used to set the chromatin-modification state of overlapping sequences. This regulatory strategy might be used more widely both groups present preliminary observations, suggesting that ncRNA might regulate expression of other yeast genes. Furthermore, in higher eukaryotes, ncRNA are implicated in genomic imprinting ( Edwards and Ferguson-Smith, 2007 ) and the function of some enhancers ( Drewell وآخرون, 2002 ). Perhaps these transcription events serve to establish epigenetic marks that influence the function of the overlapping regulatory elements.


Functions and Mechanisms of Long ncRNAs

Like protein-coding genes, there is considerable variability in the function of long ncRNAs, yet clear themes in the data suggest that many long ncRNAs contribute to associated biologic processes. These processes typically relate to transcriptional regulation or mRNA processing, which is reminiscent of miRNAs and may indicate a similar sequence-based mechanism akin to miRNA binding to seed sequences on target mRNAs. However, unlike miRNAs, long ncRNAs show a wide spectrum of biologic contexts that show greater complexity to their functions.

Epigenetic Transcriptional Regulation

The most dominant function explored in lncRNA studies relates to epigenetic regulation of target genes. This typically results in transcriptional repression, and many lncRNAs were first characterized by their repressive functions, including ANRIL, HOTAIR, H19, KCNQ1OT1، و XIST (10, 47, 55). These lncRNAs achieve their repressive function by coupling with histone-modifying or chromatin-remodeling protein complexes.

The most common protein partners of lncRNAs are the PRC1 and PRC2 polycomb repressive complexes. These complexes transfer repressive posttranslational modifications to specific amino acid positions on histone tail proteins, thereby facilitating chromatin compaction and heterochromatin formation in order to enact repression of gene transcription. PRC1 may comprise numerous proteins, including BMI1, RING1, RING2, and Chromobox (CBX) proteins, which act as a multiprotein complex to ubiquitinate histone H2A at lysine 119 (61). PRC2 is classically composed of EED, SUZ12, and EZH2, the latter of which is a histone methyltransferase enzymatic subunit that trimethylates histone 3 lysine 27 (61). Both EZH2 and BMI1 are upregulated in numerous common solid tumors, leading to tumor progression and aggressiveness (13, 61).

Indeed, ANRIL, HOTAIR, H19, KCNQ1OT1، و XIST have all been linked to the PRC2 complex, and in all except H19, direct binding has been observed between PRC2 proteins and the ncRNA itself (40, 48, 55, 62, 63). Binding of lncRNAs to PRC2 proteins, however, is common and observed for ncRNAs, such as PCAT-1, which do not seem to function through a PRC2-mediated mechanism. It is estimated that nearly 20% of all lncRNAs may bind PRC2 (64), although the biologic meaning of this observation remains unclear. It is possible that PRC2 promiscuously binds lncRNAs in a nonspecific manner. However, if lncRNAs are functioning in a predominantly رابطة الدول المستقلة-regulatory mechanism—such as ANRIL, KCNQ1OT1، و XIST—then numerous lncRNAs may bind PRC2 to facilitate local gene expression control throughout the genome. Relatedly, studies of PRC2-ncRNA-binding properties have shown a putative PRC2-binding motif that includes a GC-rich double hairpin, indicating a structural basis for PRC2-ncRNA binding in many cases (40).

Similarly, PRC1 proteins, particularly CBX proteins, have been implicated in ncRNA-based biology. على سبيل المثال، ANRIL binds CBX7 in addition to PRC2 proteins, and this interaction with CBX7 recruits PRC1 to the INK4A/ARF locus to mediate transcriptional silencing (47). More broadly, work with mouse polycomb proteins showed that treatment with RNase abolished CBX7 binding to heterochromatin on a global level, supporting the notion that ncRNAs are critical for PRC1 genomic recruitment (65).

While PRC1 and PRC2 are perhaps the most notable partners of lncRNAs, numerous other epigenetic complexes are implicated in ncRNA-mediated gene regulation. For example, the 3′ domain of HOTAIR contains a binding site for the LSD1/CoREST, a histone deacetylase complex that facilitates gene repression by chromatin remodeling (Fig. 3A) (56). AIR is similarly reported to interact with G9a, an H3K9 histone methyltransferase (66). KCNQ1OT1 has been shown to interact with PRC2 (63), G9a (63), and DNMT1, which methylates CpG dinucleotides in the genome. More rarely, lncRNAs have been observed in the activation of epigenetic complexes. In a recent example, HOTTIP interacted with WDR5 to mediate recruitment of the MLL histone methyltransferase to the distal HoxA locus (52). MLL transfers methyl groups to H3K4me3, thereby generating open chromatin structures that promote gene transcription.

Mechanisms of lncRNA function. أ, lncRNAs, such as HOTAIR, may serve as a scaffolding base for the coordination of epigenetic or histone-modifying complexes, including Polycomb repressive complexes and LSD1/CoREST. ب, eRNAs transcribed from gene enhancers may facilitate hormone signaling by cooperating with lineage-specific complexes such as FOXA1 and AR. ج, lncRNAs may directly affect tumor suppressor signaling either by transcriptional regulation of tumor suppressor genes through epigenetic silencing (e.g., ANRIL, top) or by mediating activation of tumor suppressor target genes (e.g., linc-p21, bottom). د، ال MALAT1 lncRNA may be an integral component of the nuclear paraspeckle and may contribute to posttranscriptional processing of mRNAs. ه, gene expression regulation may occur through direct lncRNA-mRNA interactions that arise from hybridization of homologous sequences and can serve as a signal for STAU1-mediated degradation of the mRNA. F, RNA molecules, including mRNAs, pseudogenes, and ncRNAs, can serve as molecular sponges for miRNAs. This generates an environment of competitive binding of miRNAs to achieve gene expression control based on the degree of miRNA binding to each transcript. The colored triangles represent different miRNA binding sites in a transcript. CDS, coding sequence.

In some cases, the mere act of lncRNA transcription is critical for the recruitment of protein complexes. Studies on H19, KCNQ1OT1، و AIR suggest that transcriptional elongation of these genes is an important component of their function (34, 53, 54). By contrast, other lncRNAs, including HOTTIP as well as many عبر-regulatory lncRNAs, do not show this relationship (52). For these lncRNAs, biologic function may be centrally linked to their role as flexible scaffolds. In this model, lncRNAs serve as tethers that rope together multiple protein complexes through a loose arrangement. Supporting this model are the multiple lncRNAs found to bind multiple protein complexes, such as ANRIL (binding PRC1 and PRC2) and HOTAIR (binding PRC2 and LSD1/CoREST) (Fig. 3A).

Enhancer-Associated Long ncRNAs

In addition to facilitating epigenetic changes that impact gene transcription, emerging evidence suggests that some ncRNAs contribute to gene regulation by influencing the activity of gene enhancers. على سبيل المثال، HOTTIP is implicated in chromosomal looping of active enhancers to the distal HoxA locus (52), but knockdown and overexpression of HOTTIP is not sufficient to alter chromosomal confirmations (52). There is also a report of local enhancer-like ncRNAs that typically lack the H3K4me1 enhancer histone signature but possess H3K4me3 and function to potentiate neighbor gene transcription in a manner independent of sequence orientation (67).

A major recent development has been the discovery of eRNAs, which are critical for the proper coordination of enhancer genomic loci with gene expression regulation. Although the mechanism of their action is still unclear, in prostate cancer cells, induction of AR signaling increased eRNA synthesis at AR-regulated gene enhancers, suggesting that eRNAs facilitate active transcription on induction of a signaling pathway (29). Using chromatin conformation assays, Wang and colleagues (29) showed that eRNAs are also important for the establishment of enhancer-promoter genomic proximity by chromosomal looping. Moreover, eRNAs work in conjunction with cell lineage specific transcription factors, such as FOXA1 in prostate cells, thereby creating a highly specialized enhancer network to regulate transcription of genes in individual cell types (Fig. 3B) (29). Future work in this area will likely provide insight into signaling mechanisms important in cancer.

Modulating Tumor Suppressor Activity

The role of many lncRNAs as transcriptional repressors lends itself to inquiry as a mechanism for suppression of tumor suppressor genes. Here, one particular hot spot is the chromosome 9p21 locus, harboring the tumor suppressor genes CDKN2A و CDKN2B, which give rise to multiple unique isoforms, such as p14, p15, and p16, and function as inhibitors of oncogenic cyclin-dependent kinases. Expression of this region is affected by several repressive ncRNAs, such as ANRIL (Fig. 3C, top) and the p15-Antisense RNA, the latter of which also mediates heterochromatin formation through repressive histone modifications and has been observed in leukemias (47, 68).

Several lncRNAs are implicated in the regulation of p53 tumor suppressor signaling. MEG3, a maternally expressed imprinted lncRNA on Chr14q32, has been shown to activate p53 and facilitate p53 signaling, including the enhancement of p53 binding to target gene promoters (69). MEG3 has also been linked to p53 signaling in meningioma (70), and MEG3 overexpression suppresses cell proliferation in meningioma and hepatocellular carcinoma cell lines (70, 71). In human tumors, MEG3 downregulation is widely noted, with frequent hypermethylation of its promoter observed in pituitary tumors (10) and leukemias (72). Taken together, these data implicate MEG3 as a putative tumor suppressor.

A recently described murine lncRNA located near the p21 gene, termed linc-p21, has also emerged as a promising p53-pathway gene. In murine lung, sarcoma, and lymphoma tumors, linc-p21 expression is induced on activation of p53 signaling and represses p53 target genes through a physical interaction with hnRNP-K, a protein that binds the promoters of genes involved in p53 signaling (Fig. 3C, bottom) (73). linc-p21 is further required for proper apoptotic induction (73). These data highlight linc-p21 as a candidate tumor suppressor gene. However, due to sequence differences among species, it is currently unclear whether the human homolog of linc-p21 plays a similarly important role in human tumor development.

Regulation of mRNA Processing and Translation

While many lncRNAs operate by regulating gene transcription, posttranscriptional processing of mRNAs is also critical to gene expression. A primary actor in these processes is the nuclear paraspeckle, a subcellular compartment found in the interchromatin space within a nucleus and characterized by PSP1 protein granules (74). Although nuclear paraspeckle functions are not fully elucidated, this structure is known to be involved in a variety of posttranscriptional activities, including splicing and RNA editing (74). Paraspeckles are postulated to serve as storage sites for mRNA prior to its export to the cytoplasm for translation, and one study discovered a paraspeckle-retained, polyadenylated nuclear ncRNA, termed CTN-RNA, that is a counterpart to the protein-coding murine CAT2 (mCAT2) gene (75). CTN-RNA is longer than mCAT2, and under stress conditions, cleavage of CTN-RNA الى mCAT2 coding transcript resulted in increased mCAT2 protein (75).

In cancer, two ncRNAs involved in mRNA splicing and nuclear paraspeckle function, MALAT1 و NEAT1, are overexpressed. MALAT1 و NEAT1 are genomic neighbors on Chr11q13 and both are thought to contribute to gene expression by regulating mRNA splicing, editing, and export (Fig. 3D) (76, 77). MALAT1 may further serve as a precursor to a small 61-bp ncRNA that is generated by RNase P cleavage of the primary MALAT1 transcript and exported into the cytoplasm (78). Although a unique role for MALAT1 in cancer is not yet known, its overexpression in lung cancer predicts for aggressive, metastatic disease (79).

Regulatory RNA-RNA Interactions

Recent work on mechanisms of RNA regulation has highlighted a novel role for RNA-RNA interactions between ncRNAs and mRNA sequences. These interactions are conceptually akin to miRNA regulation of mRNAs, because sequence homology between the ncRNA and the mRNA is important to the regulatory process.

This sequence homology may be derived from ancestral repeat elements that contribute sequence to either the untranslated sequences of a protein-coding gene or, less frequently, the coding region itself. For example, STAU1-mediated mRNA decay involves the binding of STAU1, an RNA degradation protein, to protein-coding mRNAs that interact with lncRNAs containing ancestral Alu repeats. In this model, sequence repeats, typically Alus, in lncRNAs and mRNAs partially hybridize, forming double-stranded RNA complexes that then recruit STAU1 to implement RNA degradation (Fig. 3E) (80). A related concept is found with XIST, which contains a conserved repeat sequence, termed RepA, in its first exon. RepA is essential for XIST function, and the RepA sequence is necessary to recruit PRC2 proteins for X-chromosome inactivation (40).

Poliseno and colleagues (81) recently posited another model for mRNA regulation in which they suggested that transcribed pseudogenes serve as a decoy for miRNAs that target the protein-coding mRNA transcripts of their cognate genes. Sequestration of miRNAs by the pseudogene then regulates the gene expression level of the protein-coding mRNA indirectly (Fig. 3F). In addition to pseudogenes, this model more broadly suggests that all long ncRNAs, as well as other protein-coding mRNAs, may function as molecular “sponges” that bind and sequester miRNAs in order to control gene expression indirectly. These researchers showed that pseudogenes of two cancer genes, PTEN و KRAS, may be biologically active, and that PTENP1, a pseudogene of PTEN that competes for miRNA binding sites with PTEN, itself functions as a tumor suppressor in في المختبر assays and may be genomically lost in cancer (81). This intriguing hypothesis may shed new light on the functions of ncRNAs, pseudogenes, and even the untranslated regions of a protein-coding gene.


Bombay Blood Group

The Hh Blood Group System

The Hh blood group system is composed of one gene (FUT1) located on chromosome 19q. It has four exons over 8 kbp of genomic DNA that encodes the gene product, 2-α-fucosyltransferase, an enzyme. The fucosyltransferase adds a fucose to a galactose located on type 2 carbohydrates on cellular surfaces. The function of the fucose may be in cellular adhesion or microorganism attachment. Homozygous genetic inactivation of the FUT1 or of the guanosine diphosphate (GDP)-fucose transporter gene (SLC35C1) can result in absent 2-α-fucoysltransferase enzyme activity, rendering red cell surfaces devoid of H antigen. Either genetic mechanism that leads to an H-deficient situation results in the Bombay (Oح). The Bombay phenotype usually results from a mutation in FUT1 combined with a nonsecretor phenotype (FUT2). The para-Bombay phenotype results from a mutation in FUT1 combined with a secretor phenotype (FUT2).

The phenotypic expression of H antigen is influenced by the ABO and secretor (FUT2) genes. The ABO gene product is a glycosyltransferase enzyme that adds an immunodominant carbohydrate to the H antigen the A phenotype is created by the 3-α-ن-acetylgalactosaminyltransferase that adds GalNAc to the H antigen and the B phenotype is created by the 3-α-galactosaminyltransferase that adds galactose (Gal) to the H antigen the AB phenotype has both enzyme activities and the O phenotype (recessive) has no functional enzyme, usually due to a premature stop codon in the gene. The O phenotype has the highest H antigen density on the red cell surface (approximately 1.7 million per red cell) due to the absence of ABO glycosyltransferase activity. The frequency of the O phenotype is approximately 45% of Caucasians, 49% of Blacks, and 43% of Asians. The ABO glycosyltransferases cover up the H precursors proportionally to the relative enzymatic activity, although all cells (except for Oح and para-Bombay) carry some H antigen that remains unaltered by the ABO glycosyltransferases. The order from the highest number of H antigens on the red cell surface to the lowest is O > A2 > A2B > A1 > A1B. Because the ABO antigens are built on the H antigen precursor, they are not expressed in Bombay (Oح) phenotype when there are no H antigens present. The secretor (FUT2) gene encodes another fucosyltransferase that adds H antigen to secretions, such as saliva. People with para-Bombay phenotype have a mutated FUT2 (homozygous), rendering red cells devoid of H antigen, but have a functional FUT2 gene product (secretor) thus, H antigen is present in secretions and absent (or occasionally present in low levels) on red cells.

The H antigen occurs in 99.9% of all populations. The highest frequency of Oح phenotype is in people descended from the Indian subcontinent that is usually due to an inactivating missense mutation of FUT1 combined with the nonsecretor state. The prevalence in some regions of India is estimated to be 0.048% of the population. Bombay phenotype may be associated with consanguinity. Taiwan’s population also has a relatively high rate of Bombay phenotype (up to 0.012%).


Anway MD, Cupp AS, Uzumcu M, Skinner MK. Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility. علم. 2005308(5727):1466–9.

Jirtle RL, Skinner MK. Environmental epigenomics and disease susceptibility. نات ريف جينيت. 20078(4):253–62.

Nilsson E, Sadler-Riggleman I, Skinner MK. Environmentally induced epigenetic transgenerational inheritance of disease. Environ Epigenetics. 20184(2):1–13.

Manikkam M, Guerrero-Bosagna C, Tracey R, Haque MM, Skinner MK. Transgenerational actions of environmental compounds on reproductive disease and identification of epigenetic biomarkers of ancestral exposures. PLoS ONE. 20127(2):1–12.

Chamorro-Garcia R, Sahu M, Abbey RJ, Laude J, Pham N, Blumberg B. Transgenerational inheritance of increased fat depot size, stem cell reprogramming, and hepatic steatosis elicited by prenatal exposure to the obesogen tributyltin in mice. Environ Health Perspect. 2013121(3):359–66.

Gapp K, Jawaid A, Sarkies P, Bohacek J, Pelczar P, Prados J, et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 201417(5):667–9.

Jawaid A, Roszkowski M, Mansuy IM. Transgenerational Epigenetics of Traumatic Stress. Prog Mol Biol Transl Sci. 2018158:273–98.

Yan W. Potential roles of noncoding RNAs in environmental epigenetic transgenerational inheritance. Mol Cell Endocrinol. 2014398(1–2):24–30.

Burdge GC, Lillycrop KA, Jackson AA. Nutrition in early life, and risk of cancer and metabolic disease: alternative endings in an epigenetic tale? Br J Nutr. 2009101(5):619–30.

Zheng X, Chen L, Li M, Lou Q, Xia H, Wang P, et al. Transgenerational variations in DNA methylation induced by drought stress in two rice varieties with distinguished difference to drought resistance. PLoS ONE. 20138(11):e80253.

Suter L, Widmer A. Environmental heat and salt stress induce transgenerational phenotypic changes in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 20138(4):e60364.

Norouzitallab P, Baruah K, Vandegehuchte M, Van Stappen G, Catania F, Vanden Bussche J, et al. Environmental heat stress induces epigenetic transgenerational inheritance of robustness in parthenogenetic Artemia model. FASEB J. 201428(8):3552–63.

Waddington CH. Gene assimilation of an acquired character. Evolution. 19537:118–26.

Greer EL, Maures TJ, Ucar D, Hauswirth AG, Mancini E, Lim JP, et al. Transgenerational epigenetic inheritance of longevity in Caenorhabditis elegans. طبيعة سجية. 2011479(7373):365–71.

Carvan M, Kalluvila TA, Klingler RH, Larson JK, Pickens M, Mora-Zamorano FX, et al. Mercury-induced epigenetic transgenerational inheritance of abnormal neurobehavior is correlated with sperm epimutations in zebrafish. PLoS ONE. 201712(5):1–26.

Knecht AL, Truong L, Marvel SW, Reif DM, Garcia A, Lu C, et al. Transgenerational inheritance of neurobehavioral and physiological deficits from developmental exposure to benzo[a]pyrene in zebrafish. Toxicol Appl Pharmacol. 2017329:148–57.

Bhandari RK, vom Saal FS, Tillitt DE. Transgenerational effects from early developmental exposures to bisphenol A or 17alpha-ethinylestradiol in medaka لاتيبس اوريزيا. Sci Rep. 20155:9303.

Leroux S, Gourichon D, Leterrier C, Labrune Y, Coustham V, Riviere S, et al. Embryonic environment and transgenerational effects in quail. Genet Sel Evol. 201749(1):14.

Brun JM, Bernadet MD, Cornuez A, Leroux S, Bodin L, Basso B, et al. Influence of grand-mother diet on offspring performances through the male line in Muscovy duck. BMC Genet. 201516(1):145.

Braunschweig M, Jagannathan V, Gutzwiller A, Bee G. Investigations on transgenerational epigenetic response down the male line in F2 pigs. PLoS ONE. 20127(2):e30583.

Bygren LO, Tinghog P, Carstensen J, Edvinsson S, Kaati G, Pembrey ME, et al. Change in paternal grandmothers’ early food supply influenced cardiovascular mortality of the female grandchildren. BMC Genet. 201415:12.

Veenendaal MV, Painter RC, de Rooij SR, Bossuyt PM, van der Post JA, Gluckman PD, et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the 1944–45 Dutch famine. BJOG. 2013120(5):548–53.

Skinner MK. Environmental epigenetics and a unified theory of the molecular aspects of evolution: a Neo-Lamarckian concept that facilitates Neo-Darwinian evolution. Genome Boil Evol . 20157(5):1296–302.

Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, McBirney M, Nilsson E, Klukovich R, et al. Alterations in sperm DNA methylation, non-coding RNA expression, and histone retention mediate vinclozolin-induced epigenetic transgenerational inheritance of disease. Environ Epigenetics. 20184(2):1–19.

Skinner MK, Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, Nilsson E, McBirney M, et al. Alterations in sperm DNA methylation, non-coding RNA and histone retention associate with DDT-induced epigenetic transgenerational inheritance of disease. Epigenetics Chromatin. 201811(1):8.

Cuerda-Gil D, Slotkin RK. Non-canonical RNA-directed DNA methylation. Nat Plants. 20162(11):16163.

Chow HT, Chakraborty T, Mosher RA. RNA-directed DNA Methylation and sexual reproduction: expanding beyond the seed. Curr Opin Plant Biol. 201954:11–7.

Matzke MA, Mosher RA. RNA-directed DNA methylation: an epigenetic pathway of increasing complexity. نات ريف جينيت. 201415(6):394–408.

Kouzarides T. Chromatin modifications and their function. زنزانة. 2007128(4):693–705.

Jenkins TG, Carrell DT. The sperm epigenome and potential implications for the developing embryo. Reproduction. 2012143(6):727–34.

Jenkins TG, Carrell DT. The paternal epigenome and embryogenesis: poising mechanisms for development. Asian J Androl. 201113(1):76–80.

Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, Skinner MK. Epigenetic transgenerational inheritance of altered sperm histone retention sites. Sci Rep. 20188:5308.

King SE, McBirney M, Beck D, Sadler-Riggleman I, Nilsson E, Skinner MK. Sperm epimutation biomarkers of obesity and pathologies following DDT induced epigenetic transgenerational inheritance of disease. Environ Epigenetics. 20195(2):1–15.

Nilsson E, King SE, McBirney M, Kubsad D, Pappalardo M, Beck D, et al. Vinclozolin induced epigenetic transgenerational inheritance of pathologies and sperm epimutation biomarkers for specific diseases. PLoS ONE. 201813(8):1–29.

Saenen ND, Martens DS, Neven KY, Alfano R, Bove H, Janssen BG, et al. Air pollution-induced placental alterations: an interplay of oxidative stress, epigenetics, and the aging phenotype? Clinical epigenetics. 201911(1):124.

Kumar S, Kumari R, Sharma V, Sharma V. Roles, and establishment, maintenance and erasing of the epigenetic cytosine methylation marks in plants. J Genet. 201392(3):629–66.

Ooi SL, Henikoff S. Germline histone dynamics and epigenetics. Curr Opin Cell Biol. 200719(3):257–65.

van der Heijden GW, Derijck AA, Ramos L, Giele M, van der Vlag J, de Boer P. Transmission of modified nucleosomes from the mouse male germline to the zygote and subsequent remodeling of paternal chromatin. Developmental biology. 2006298(2):458–69.

Meyer-Ficca ML, Lonchar JD, Ihara M, Meistrich ML, Austin CA, Meyer RG. Poly(ADP-ribose) polymerases PARP1 and PARP2 modulate topoisomerase II beta (TOP2B) function during chromatin condensation in mouse spermiogenesis. Biol Reprod. 201184(5):900–9.

Hammoud S, Liu L, Carrell DT. Protamine ratio and the level of histone retention in sperm selected from a density gradient preparation. Andrologia. 200941(2):88–94.

Berson A, Nativio R, Berger SL, Bonini NM. Epigenetic regulation in neurodegenerative diseases. الاتجاهات العصبية. 201841(9):587–98.

Zhao M, Shirley CR, Yu YE, Mohapatra B, Zhang Y, Unni E, et al. Targeted disruption of the transition protein 2 gene affects sperm chromatin structure and reduces fertility in mice. Mol Cell Biol. 200121(21):7243–55.

Vymetalkova V, Vodicka P, Vodenkova S, Alonso S, Schneider-Stock R. DNA methylation and chromatin modifiers in colorectal cancer. Mol Aspects Med. 201969:73–92.

McBirney M, King SE, Pappalardo M, Houser E, Unkefer M, Nilsson E, et al. Atrazine induced epigenetic transgenerational inheritance of disease, lean phenotype and sperm epimutation pathology biomarkers. PLoS ONE. 201712(9):1–37.


Imprinted Macro ncRNA Biology

We are in the early stages of understanding how the Airn و Kcnq1ot1 macro ncRNAs act to repress genes in cis. In particular, it is of interest to know if these two macro ncRNAs possess special properties relevant for their function that could also be typical of other macro ncRNAs. على حد سواء Airn و Kcnq1ot1 are RNAPII transcripts but are atypical RNPII transcripts because they are unusually large, mostly unspliced and not exported to the cytoplasm. 20 , 42 Both are described as ‘macro’ ncRNAs as Airn is 108 kb and Kcnq1ot1 is 91.5 kb ( Fig. 5 ). A small percentage (ρ%) of Airn transcripts are variably spliced to ncRNAs of approximately 1 kb and exported to the cytoplasm. Spliced Airn transcripts are 9 fold more stable than the unspliced transcript but are predicted to be non-functional. Kcnq1ot1 appears to lack any spliced variants ( Fig. 5 ). In contrast, the non-functional H19 ncRNA is a fully spliced ncRNA that is exported to the cytoplasm 43 however, it is atypical in that it has a low intron/exon ratio ( Fig. 5 ).

Genomic organization of imprinted macro ncRNAs. The genome position (UCSC Genome Browser on Mouse July 2007 Assembly), size and orientation of the 108 kb Airn ncRNA (A), the 91.5 kb Kcnq1ot1 ncRNA (B), and the 2.26 kb H19 ncRNA (C) is shown. ال Airn و Kcnq1ot1 promoters are associated with CpG islands that lie in the ICE (white star), the H19 promoter lies 5 kb downstream of the ICE that is only moderately CG rich. Airn transcripts are mostly unspliced and nuclear-localized, but 5% of transcripts are spliced with the indicated organization and exported to the cytoplasm. 20 The Airn spliced variants (SV) all use the same splice donor (at +53 bp) but all use different 2 nd exons. The dotted rectangle indicates the full length of the unspliced Airn transcript as shown by oligo tiling array hybridization. 48 The small box inside the dotted rectangle indicates an annotated Airn EST. Kcnq1ot1 appears to lack spliced transcripts and is localized the nucleus. 42 H19 appears to be fully spliced but shows an unusually high exon/intron ratio and is exported to the cytoplasm. A biallelically-expressed and nuclear-localized transcript of unknown function has also been identified at the H19 ICE in embryonic liver tissue. 51 Note that Airn و Kcnq1ot1 have an antisense transcription overlap with one gene however, only Airn overlaps a promoter. The presence of interspersed repeats that are contained in the Airn و Kcnq1 but not H19 macro ncRNAs is shown underneath. H19 also contains the mir-675 miRNA. Airn contains a small oocyte RNA from the Au76 pseudogene (*).

While mammalian genes are often larger than 50 kb𠅎.g., the DMD gene is the largest known mouse gene that is 2,256 kb long and spliced to a 13.8 kb transcript containing 79 exons mature spliced mRNA transcripts are rarely larger than 10� kb. Thus mammalian mRNA genes normally have a high intron to exon ratio. Single exon mammalian mRNA genes do exist, however, they are normally short transcripts in the order of 1 kb that are exported to the cytoplasm. A consequence of the large size and unspliced nature of Airn و Kcnq1ot1 is that they contain transposons, which comprise approximately 50% of the mouse genome and are equally distributed in genes and intergenic regions. 44 Thus an additional atypical feature is that imprinted macro ncRNAs contain transposons, which are only rarely found in mRNAs ( Fig. 5 ). Since transposons are usually subject to DNA methylation and silenced in a differentiated cell genome, 45 mature RNAs containing transposon sequences are rare and open the possibility that they contribute to the repressor function of imprinted macro ncRNAs.

Experiments to identify functional regions within Airn و Kcnq1ot1 are in progress and we currently lack a clear picture of key regions within these ncRNAs. However, it is possible that the absence of splicing is related to macro ncRNA function. Exon-junction-complexes that mark spliced junctions may be used to target the nuclear export machinery and absence of splicing in macro ncRNAs may prevent nuclear export. The control of mRNA splicing is still a topic of active investigation. However, it is generally thought that RNAPII transcripts are co-transcriptionally processed to spliced products that are exported to the cytoplasm, because the elongating form of RNAPII recruits both splicing and polyadenylation proteins. 46 Recently, the polyadenylation complex was shown in yeast to recruit nuclear export factors. 47 Since RNAPII is recruited to the promoter, this may indicate a unique property of macro ncRNA promoters is to recruit a form of RNAPII that is unable to subsequently recruit splicing and polyadenylation factors. This has been directly tested for the Airn promoter by experiments that deleted the endogenous promoter and replaced it with the Pgk1 promoter that normally transcribes a 16.6 kb gene spliced to a 1.8 kb transcript containing 11 exons. 48 Surprisingly, the resultant Pgk-Airn transcript retained all properties of the endogenous Airn ncRNA. Pgk-Airn transcripts were 108 kb long and only produced a low level of spliced variants, and importantly, they retained the ability to repress Igf2r in cis. Thus the lack of Airn splicing appears to be regulated independently of its promoter sequence and RNAPII recruitment. This result contrasts with a study in yeast that swapped two mRNA promoters and showed that splicing regulation was promoter driven. 49 Further work will be needed to identify functional regions within the Airn و Kcnq1ot1 macro ncRNAs.


أساليب

Data sources

In order to evaluate the performance of the approach, we prepared two kinds of data, ncRNA-target interaction matrix (LncRNADisease database (2015)) and target-disease interaction matrix (DisGeNET database) which are the same database sources used in Chen et al. (2013) [15], to form the tripartite network, as well as the sequence expression of those targets and ncRNAs (extracted from Uniprot and LncRNADisease databases, respectively). Since there are ncRNA sequence expressions and targets that are still unknown, we could only collect 76 ncRNAs, 109 targets, and 514 diseases (see Table 1). In Fig. 1, the degree distribution of the resulting network is shown. The results indicate that the entire network may follow a power law distribution. Moreover, we collected experimentally confirmed interactions between ncRNAs and miRNAs from the database shown in [16] and from Alaimo [13] Supplementary Information files and reconstructed another dataset composed on 151 ncNRAs, 179 targets and 134 diseases (see Helwak dataset in Table 1).