معلومة

كيف نضع الجين تحت سيطرة محفز خاضع للتنظيم؟

كيف نضع الجين تحت سيطرة محفز خاضع للتنظيم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لنفترض أن لدي تسلسل جيني مغاير (حقيقيات النوى ، نباتي) أريد التعبير عنه في E Coli تحت سيطرة مروج منظم (لنقل محفز lac الناجم عن IPTG) كيف بالضبط يضيف المرء تسلسل المروج في بداية الجين؟

هل توجد أي أدوات للقيام بذلك؟

على سبيل المثال لنفترض أن هذا هو الجين نفسه ، فما هو تعديل التسلسل المطلوب لوضعه تحت سيطرة محفز lac؟ الهدف هو إحداث إفراط في التعبير عن البروتين المشفر بواسطة الجين عند إضافة IPTG إلى الوسط (إذا فهمت الإستراتيجية بشكل صحيح)

atggctaccg ataatgacag ctctgaaaac cgtcgtatgg gtaattacaa gccgtccatc 60 tggaactacg acttcctgca gtccctggct acccgccaca atatcatgga agagcgccac 120 ttgaaactgg cggagaaact gaaaggccag gtgaagttta tgtttggtgc cccgatggag 180 ... gagccgttcg tgacgttcaa cctgaacagc gttcgtggtt cccatttctt ttacgagttt 1560 ggtgacggtt tcggtgtgac gaatagctgg accaaggttg acatgaagag cgtcctgatt 1620 gatccgattc cactggatga agaataatga 1650

إذا كنت تعبر عن الجين في الإشريكية القولونية ، فمن المؤكد أنك تستخدم بلازميد أو ناقل جيني خارج الرحم. تتوفر مجموعة متنوعة من البلازميدات ، مع العديد من المحفزات المختلفة. باستخدام البلازميد التجاري ، فأنت لا تضيف تسلسل المحفز ، بل تضيف تسلسل الجينات. يمكنك اختيار المروج الذي تريده ثم استنساخ تسلسل الجين الخاص بك في موقع الاستنساخ المتعدد للبلازميد ، والذي تم تصميمه لاستلقاء المروج في اتجاه مجرى النهر.

توجد مجموعة متنوعة من الأدوات لتصميم وترتيب البلازميدات. مستودع البلازميد الشائع هو addgene وأداتي المفضلة لتصميم البلازميدات قبل الطلب هي APE.

صمم البلازميد باستخدام APE أو أي أداة أخرى ، للتأكد من أن كل شيء يبدو جيدًا ، ثم يمكنك طلب متجه البلازميد المناسب وتسلسل الجين المحاط بالموقع وقطع الإنزيم والانتقال إلى استنساخ المدينة.


موقع دخول الريبوسوم الداخلي

ان موقع دخول الريبوسوم الداخلي، مختصر IRES، هو عنصر RNA يسمح ببدء الترجمة بطريقة مستقلة عن الغطاء ، كجزء من عملية أكبر لتخليق البروتين. في الترجمة حقيقية النواة ، يحدث البدء عادةً في 5 'نهاية جزيئات mRNA ، حيث يلزم التعرف على الغطاء 5' لتجميع مجمع البدء. غالبًا ما يكون موقع عناصر IRES في 5'UTR ، ولكن يمكن أن يحدث أيضًا في مكان آخر في mRNAs.


مقدمة

الأوعية الدموية هي عضو هدف فريد للعلاج الجيني. يوفر عددًا من الفوائد لنقل الجينات ، وأهمها سهولة الوصول إلى الجين المحول ونقله إلى موقع معين أو إلى الأوعية الدموية بأكملها. يمكن أيضًا إفراز منتجات الجينات المعدلة وراثيًا محليًا أو في مجرى الدم للحصول على تأثير نظامي .1 في النماذج الحيوانية ، تم استخدام نقل الجينات الوعائية بنجاح لتغيير التكوين النسيجي والتفاعل الحركي الوعائي وتحفيز تكوين الأوعية الدموية .23 ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من بروتوكولات العلاج الجيني يشارك في علاج السرطان. تشمل الاستراتيجيات التي تخضع حاليًا للتحقيق السريري لعلاج السرطان دراسة الجينات التي تنشط أو تكوّد السموم الخلوية ومُعدِّلات المناعة .45

يعتمد نجاح الطرق غير الجراحية لعلاج السرطان على إمداد الورم بالدم. تم الإبلاغ عن أن الضرر الذي يلحق بأوعية واحدة يمكن أن يتسبب في موت الآلاف من الخلايا السرطانية التابعة وأن عددًا صغيرًا فقط من الخلايا البطانية يجب أن يتأثر لتعطيل الأوعية الدموية. دون التسبب في تلف الأوعية الدموية الطبيعية.

أكسيد النيتريك (NO) هو وسيط بيولوجي قوي له وظائف فسيولوجية وفسيولوجية مرضية متنوعة. يمكن أن يكون بمثابة موسع للأوعية ، وناقل عصبي ، وجزيء مؤثر مضاد للميكروبات ، ومعدِّل مناعي .7 ويتم إنتاجه بواسطة واحد من ثلاثة أشكال إسوية متميزة من جين أكسيد النيتريك سينثيز (NOS). ينتج الشكل الإسوي المحرض للإنزيم (iNOS) كميات كبيرة من أكسيد النيتروجين بطريقة مستقلة عن الكالسيوم 2+. تم الكشف عن مستويات مرتفعة من iNOS في عدد من أنسجة الورم البشرية والثديية ، 8910 على الرغم من أن أكثر من نوع واحد من الخلايا يمكن أن يعبر عن الجين. زيادة التعبير عن NOS قد يسهل توصيل الأكسجين والمواد المغذية من خلال الأوعية الدقيقة المتوسعة إلى الخلايا السرطانية سريعة الانتشار.

القيد الرئيسي لبروتوكولات العلاج الجيني هو الافتقار إلى خصوصية الهدف. تم وضع عدد من الاستراتيجيات لتوطين العلاج في المنطقة المرغوبة ، بما في ذلك استخدام مستقبلات خاصة بالأنسجة 11 ومعززات خاصة بالأنسجة 12 للتحكم في التعبير عند مستوى النسخ. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام المحفزات المحفزة لتعديل التعبير الجيني نسبيًا. تم تطوير عدد من الأنظمة المحفزة: نظام تعبير يتحكم فيه التتراسيكلين ، 13 ومحفز منظم لمضادات البروجسترون. 1415 Weichselbaum وآخرونوصف رقم 16 نظامًا محرضًا يستخدم متواليات إجماع مستجيبة للإشعاع من مروج جينات الاستجابة المبكرة للنمو (EGR) المرتبط المنبع من جين TNF-α. تم استخدام هذا النظام المحرض في الدراسات التي أبلغت عن زيادة في إنتاج الورم داخل الورم من TNF-α عندما تم حقن الفئران العارية ببنية Egr-TNF وتعرضت للإشعاع. بالجرعة الأكثر صلة سريريًا وهي 2 غراي 18

تم الإبلاغ عن عدد من الجينات عن طريق الإشعاع المؤين. قد يساعد تعديل الأوعية الدموية البشرية بهذه الطريقة في النهاية في توصيل عوامل العلاج الكيميائي من خلال الأوعية الموسعة للأوعية ، أو تعزيز توصيل الأكسجين لتقليل عدد خلايا نقص الأكسجة المقاومة للإشعاع.


القتل الانتقائي لخلايا سرطان الخلايا الكبدية الإيجابية لـ AFP عن طريق نقل الفيروس المرتبط بـ Adeno من جين فيروس الهربس البسيط Thymidine Kinase

تمت دراسة استخدام جين ثيميدين كيناز الفيروسي (TK) إلى جانب إعطاء ganciclovir لجعل موت الخلايا السرطانية على نطاق واسع. استخدمت العديد من هذه التجارب الفيروسات القهقرية لنقل جين TK تحت سيطرة محفز غير محدد. نظرًا لأن التعبير غير المحدد عن جين TK الفيروسي قد يتسبب في موت الخلايا المتكاثرة ، بخلاف الخلايا السرطانية ، فقد استكشفنا استخدام محفز خاص بالكبد ومُحسِّن خاص بالورم من أجل تحقيق التعبير الجيني TK الفيروسي المنظم لعلاج سرطان الخلايا الكبدية. استخدمنا أيضًا الفيروس المرتبط بالغدية (AAV) كناقل لإيصال جين TK لأن هذا الفيروس لا يرتبط بأي عواقب مرضية على البشر. نظرًا لأنه يمكن أن يصيب خلايا المرحلة S غير المنقسمة ، يمكن لـ AAV نقل الجينات إلى خلايا الورم غير الدورية. تم إنشاء فيروس AAV المؤتلف ليشمل جين العلامة المختارة neo R وجين فيروس الهربس البسيط (HSV) -TK مدفوعًا بمُحسِّن AFP البشري ومحفز الألبومين. لوحظ نمط التعبير السائد للكبد عن جين TK عندما تم اختبار هذا التركيب في الفئران المعدلة وراثيا. عندما أصيبت سلالات خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية التي تظهر مستويات مختلفة من AFP وخطوط الخلايا السرطانية غير الكبدية بفيروس AAV المؤتلف ، تسبب علاج ganciclovir فقط في موت خلايا سرطان الخلايا الكبدية إيجابية الألبومين والـ AFP ، ولكن ليس خلايا الورم غير الكبدي أو AFP والألبومين- خلايا الورم الكبدية السلبية. علاوة على ذلك ، كانت الجرعة المطلوبة لقتل الخلايا السرطانية متناسبة عكسياً مع مستوى تعبير AFP في الخلايا.

أظهرت هذه الدراسة أنه باستخدام مُحسِّن AFP ومحفز الألبومين ، يمكن لفيروس AAV المؤتلف التعبير عن جين فيروس الهربس البسيط thymidine kinase (HSV-TK) في كبد الفئران المعدلة وراثيًا وفي خلايا سرطان الخلايا الكبدية الإيجابية. في المختبر. يتم إنتاج الفيروس المؤتلف عند حوالي 1 × 10 5 إلى 1 × 10 6 وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر في نظام الاختبار. كانت الخلايا السرطانية المنقولة حساسة للغاية للعلاجات ganciclovir في المختبر.


13: البيولوجيا الجزيئية IV (تابع) - لائحة الجينات 1

قم بتنزيل الفيديو من iTunes U أو Internet Archive.

المواضيع التي تمت تغطيتها: البيولوجيا الجزيئية IV (تابع) - لائحة الجينات 1

معلم: البروفيسور جراهام والكر

13: البيولوجيا الجزيئية IV (c.

17: متعب الكربون والطاقة.

18: الإنتاجية وشبكات الغذاء

19: تنظيم الإنتاجية

20: تحديد العوامل و Bi.

27: الحمض النووي المؤتلف III (co.

31: علم الوراثة السكانية و.

36: التطبيقات البيئية

ذكرت جوليا للتو أن القليل منكم قد علق ، عندما كنا نتحدث عن الشفرة الجينية ، أن بعضكم اعتقد أن حقيقة أنها كانت متدهورة ، وكان بها بعض التكرار ، مثل الكودونات المتعددة أو الثريونين ، وهذا نوع من رائع ، ويعتقد البعض منكم أنها كانت نوعًا ما مضيعة وربما كانت ستصمم الشيء بشكل مختلف. هذا ، كما تعلم ، جزء من دراسة علم الأحياء لا يمكنك تصميمه من المبادئ الأولى.

لقد اكتشفت ما حدث أثناء التطور وما الذي تم اختياره من أجله.

وبمجرد أن يتم اختياره لذلك يصبح نوعًا ما ثابتًا في الطبيعة.

إذا كان هناك أربعة نيوكليوتيدات ، فيمكن أن يكون لديك كلمة واحدة أو كلمتين أو ثلاثة أحرف. وستكون كلمة مكونة من ثلاثة أحرف بحيث يكون لديك 20 على الأقل ، ثم يكون لديك بعض الانحطاط أو التكرار ، لكن هذا ليس بالضرورة أمرًا سيئًا. وفي الواقع ، إذا تعمقت في تطوير الشفرة بشكل أعمق ، يبدأ الناس في الشك في أنها تطورت من رمز أبسط.

وفي الواقع هناك بعض العلاقات بين بعض الكودونات التي تعود إلى أوجه التشابه والتشابه الكيميائي بين الأحماض الأمينية. كما أنه يسمح لبعض الخلايا ببعض الأشياء ، على سبيل المثال ، إذا أرادوا أن تتواجد البروتينات بمستويات منخفضة جدًا ، فسيستخدمون كودونًا يحتوي على مستوى منخفض جدًا من الحمض الريبي النووي النقال المقابل. وإذا أرادوا إنتاج الكثير من البروتين ، فسيستخدمون الحمض الريبي النووي النقال الذي يصنعه بوفرة.

ولذا فهي نوعًا ما طريقة أخرى للتحكم في مستويات البروتينات.

هناك الكثير من التفاصيل الدقيقة المختلفة هنا.

وأيضًا في علم الأحياء ليس التكرار أمرًا سيئًا بالضرورة.

إنه يشبه تمامًا رحلة الفضاء ، إذا حدث خطأ ما وإذا كان هناك نوع من الوظائف الزائدة عن الحاجة ، فلديك بعض النسخ الاحتياطية أيضًا. نعم. حسنًا ، على أي حال ، اليوم هو جزء أول مثير للاهتمام من المحاضرة.

لقد سمعت عددًا قليلاً من الأشخاص يعبرون عن وجهة نظر مفادها أنه لماذا لا يمكنني فقط تدريس ما هو موجود في الكتاب المدرسي والاستمرار فيه؟

وأعتقد أن هذا الجزء ، لأولئك الذين يتابعون منكم ، يحاولون حقًا فهم ما أحاول فعله بهذه الدورة ، آمل أن يساعدك هذا في رؤية هذا. لأن ما تحدثت عنه ، هذا الشيء الذي أطلق عليه كريك & quotcentral dogma & quot ، والذي كان اتجاه تدفق المعلومات في علم الأحياء الذي كان من DNA إلى RNA إلى البروتينات. وسأذكرك ، على الرغم من أن البروتينات تقوم بالعديد من الأشياء فهي ، على سبيل المثال ، إنزيمات هي محفزات بيولوجية. وقد ثبت جيدًا ، حتى في الوقت الذي كنت فيه طالبًا جامعيًا ، كانت هذه هي الطريقة التي يتم بها تدفق المعلومات في علم الأحياء ، وكانت هذه هي الطريقة التي تعمل بها. وكانت هناك عبارات مختلفة في الأدبيات أن ما كان صحيحًا بالنسبة للإشريكية القولونية كان صحيحًا بالنسبة للفيل. ولا يزال هذا صحيحًا اليوم بالمعنى الواسع ، كما حاولت التأكيد خلال الدورة التدريبية ، عندما تنزل إلى مستوى الجزيء الخلوي ، هناك الكثير من الأشياء المشتركة والأشياء تبدو متشابهة أكثر بكثير مما تبدو مختلفة مقارنة بما نحن عليه انظر على نطاق أكثر عيانية. ومع ذلك ، هذا لا يعني أن جميع التفاصيل متشابهة. وربما يمكنك البدء في الحصول على لمحة عن ذلك عندما أخبرتك أنه على الرغم من أن الشفرة الجينية عالمية تقريبًا. يستخدم كل كائن حي تقريبًا ، مع استثناءات قليلة جدًا ، نفس الشفرة الجينية تمامًا لجعل النيوكليوتيدات تتطابق مع الكلمات المكونة من ثلاثة أحرف في أبجدية الحمض النووي التي تتوافق مع أحماض أمينية معينة في البروتين. لكن اللغات الأخرى المكتوبة هناك مثل التسلسل لبدء نسخ الجين ، عمل نسخة RNA توقفت.

هذه تختلف بين الكائنات الحية المختلفة. نعم؟

إن إنزيمات تحلل السكر متشابهة بشكل مثير للدهشة. من الواضح جدًا أنهم نشأوا مرة واحدة ، وبقوا على حق خلال التطور. يمكنك ، من حيث المبدأ ، في بعض الأحيان في التطور أن تحصل على شيء يخلق وظيفة وشيء يبدأ ، وبعد ذلك مثل ما يسمونه التطور المتقارب ينتهي بك الأمر إلى شيئين أتيا من أصل تطوري مختلف لكنك تعلمت القيام به ، دعنا قل ، حفز نفس التفاعل الكيميائي الحيوي أو شيء من هذا القبيل.

جاء تحلل السكر مرة واحدة. ولكن إذا نظرت داخل E.

coli أو الخميرة ، دعنا نقول E. coli وانظر إلى كيفية تنظيم هذه الإنزيمات ، الشيء الذي يقول أن هذا هو بداية الجين ، ابدأ في صنع الحمض النووي الريبي ، سيبدو مختلفًا تمامًا عما لو نظرت في فأر لأن اللغة ، المحفز ليس لديه نفس التسلسل في الإشريكية القولونية والإنسان أو في الفأر.

وسأخبركم المزيد عن ذلك اليوم. لكن كان هناك - أريد أن أخبركم الآن نوعا من ثلاثة أشياء كانت نوعا ما استثناءات لهذه الطريقة العامة في التفكير. كل واحد منهم حصل على جائزة نوبل. وهذه محاضرة ممتعة لي ألقيها لأن الأفراد المشاركين في كل هذه الأشياء كان لهم ارتباط وثيق جدًا مع معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. وعندما أخبرتك عندما أطلق كريك على هذه العقيدة المركزية ، كان يقصد فرضية ، أو على الأقل فكرة لم يكن لها دليل معقول.

وعلم فيما بعد أنه شيء لا يمكن للمؤمن الحقيقي أن يشك فيه. وبمجرد أن يتم إثبات ذلك ، فإنه يتم إدخاله في الكتاب المدرسي ويصبح في تفكيرك. وهكذا تنخفض المعلومات بهذه الطريقة. لكن كان هناك بعض الشذوذ.

أعني أنه كان هناك بعض الفيروسات التي تحتوي على RNA بداخلها.

لم يكن لديهم حمض نووي. فكيف حيث يتم التعامل مع هذه؟

حسنًا ، اتضح أن هناك فئتين من فيروسات الحمض النووي الريبي.

واحد تم دراسته بشكل مكثف ويسمى ، إنه فيروس نباتي يسمى فيروس موزاييك التبغ. وكان لها معطف. وبعد ذلك كانت تحتوي على قطعة من الحمض النووي الريبي. الآن ، يمكنك معرفة ما إذا كان هذا الفيروس سيحقن RNA في الخلية يمكنه ترميز البروتينات.

لكن يجب نسخ تلك المادة الجينية. وتم نسخ الحمض النووي الريبي - - بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي. ولذا فهو يشبه نوعًا ما بوليميراز RNA من قبل ، إلا أنه بدلاً من استخدام الحمض النووي كقالب ، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي. لذلك سيكون هذا النوع من الحلقات حلقة صغيرة هنا حول قدرة الحمض النووي الريبي على نسخ نفسه بشكل لم يكن متوقعًا. وعلى الرغم من أن هذا فيروس مهم في صناعة النباتات والنباتات والزراعة ، إلا أنه ليس مهمًا جدًا للبشر.

لكن هناك فئة أخرى من فيروسات الرنا مهمة جدًا.

وتسمى هذه الفيروسات القهقرية. والسبب في أهميتها هو أن فيروس HIV-1 المرتبط بالإيدز يعتبر من الفيروسات القهقرية. إنه فيروس له غلاف وله RNA وهو مادة وراثية. والشخص الذي عمل على كيفية حدوث ذلك كان شخصًا في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، ديف بالتيمور. لقد كان زميلًا لي هنا لسنوات عديدة. لقد كان الشخص الذي أسس معهد وايت هيد واستطاع النهوض به. ثم أخيرًا ، لرفع تحد إداري آخر ، ذهب إلى معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ليكون رئيسًا. وهذا هو مكانه اليوم.

وكان ديفيد يعمل على هذه المشكلة في محاولة لمعرفة كيفية عمل هذه الفيروسات القهقرية. وهم مهمون. ليس فقط فيروس HIV-1 ، ولكن هناك فيروسات معينة مرتبطة بالسرطان. بشكل عام ، ما يفعلونه هو أنهم التقطوا ما يسمى بالجين الورمي والذي غالبًا ما يكون نسخة متحولة من أحد جيناتك الطبيعية.

وإذا دخل هذا الفيروس إلى إحدى خلاياك وأدخل هذا الجين المتحور ، فسيكون نوعًا ما من نفس النتيجة مثل تحور أحد جيناتك مع تطور السرطان.

لذلك ، يمكن نوعًا ما ، على سبيل المثال ، إحضار خلية تقوم بفشل التحكم في الوقت الذي يُفترض أن تتكاثر فيه الخلايا وتتوقف عن الانقسام وما إلى ذلك. لذا بدأ ديفيد العمل على هذه ، وما اكتشفه هو أن هذه الفيروسات مشفرة ، ولديها معلومات ترميز البروتينات. وأحد البروتينات المشفرة في الحمض النووي الريبي الخاص بها هو إنزيم غير مميز يُطلق عليه اسم & quotreverse transcriptase & quot. وما يمكن أن يفعله هذا هو أخذ قالب RNA وعمل خيط DNA المكمل المقابل بهذه الطريقة.

لذلك إذا أخذنا - سنأخذ فقط هذا الحمض النووي الريبي من الفيروس. ما يشفره هذا الفيروس إذن هو إنزيم قادر على أخذ هذا الحمض النووي الريبي وعمل نسخة الحمض النووي المقابلة. لذلك هناك الحمض النووي الريبي الأصلي الذي كان موجودًا في الفيروس. هناك الحمض النووي الريبي الذي بدأ. ولذا فإن ما يحدث ، إذا صح التعبير في هذه الحالة ، هو أن المعلومات تتدفق في الاتجاه الآخر.

كان هذا اكتشافًا رائعًا.

واكتشفها شخص لم يكن على استعداد لمجرد أخذ ما هو موجود في الكتب المدرسية ولكنه كان يحاول معرفة ما يمكن أن يحدث هنا. الآن ، الطريقة التي تعمل بها هذه الفيروسات ، بمجرد قيامهم بذلك ، لن يكون الأمر سيئًا للغاية لأنهم حصلوا على معلوماتهم الآن في شكل الحمض النووي. لذلك يمكن تحويل هذا الشريط من الحمض النووي إلى DNA مزدوج الشريطة باستخدام أنواع الإنزيمات التي تحدثنا عنها بالفعل. إن بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي سيكون قادرًا على نسخ الشيء الآخر. والآن لديك نسخة من الحمض النووي للمعلومات التي كانت موجودة في الفيروس. لكن ما يحدث لذلك هو أن لديك قطعة من الحمض النووي للمضيف.

ثم يتم إدخال هذا الحمض النووي الفيروسي فيه ، لذلك ينتهي بك الأمر مع هذا الموقف حيث يكون لديك حمض نووي من المضيف ، وهذا هو الحمض النووي للفيروس. إذن هذا هو الحمض النووي الذي يشفر المعلومات اللازمة للفيروس. وإذا كان هذا هو حمضنا النووي ، فسيتم إدخاله بهذه الطريقة. وهناك عدد قليل من الرسائل الصحية التي حاولت نقلها إلى المنزل في هذا الشيء.

ذكرت التدخين في ذلك اليوم. إذا كنت تدخن - إذا توقفت عن التدخين بشكل أساسي ، دعني أجرب طريقة أخرى. إن خطر التدخين يساوي مجموع كل شيء آخر يمكنك القيام به في حياتك والذي سيؤثر على فرص إصابتك بالسرطان ، وترك جانباً ما ورثته عن والدك.

الشيء الوحيد الذي يجب ألا تفعله إذا كنت ترغب في تجنب السرطان ، أو مساعدة أحبائك الذين يدخنون على تجنب السرطان ، هو عدم التدخين ، أو التوقف عن التدخين إذا كنت تدخن. أنت تجمد خطر أي خطر متزايد لديك ، ثم تتعايش مع ذلك ، لكن الأمر لا يزداد سوءًا مع مرور الوقت. الآخر هو ممارسة الجنس الآمن ، ولهذا السبب. HIV-1 هو فيروس ارتجاعي. إذا أصبت به ، فإنه يصنع نسخة DNA من الحمض النووي الريبي ، يصنع الشريط الآخر من الحمض النووي ، ويلتصق بنفسه.

إذاً ما لديك هو حمضك النووي هنا ، حمضك النووي هناك.

و HIV-1 هو رفيق سفر دائم لبقية حياتك.

لا توجد طريقة لإخراج ذلك من هناك الآن.

جميع أنظمة التعامل مع الإيدز هي فقط إدارة العدوى.

لذلك عندما يكون شخص ما مصابًا بفيروس HIV-1 ، فإنهم قد حصلوا على تلك الجينات الفيروسية مدمجة بشكل دائم في الحمض النووي الخاص بهم.

لذلك من المهم للغاية أن تكون على دراية بذلك ، أو إذا كنت تعرف أشخاصًا لا يقدرون هذا لأنهم لا يمتلكون الكثير من الخلفية البيولوجية التي تساعدهم على فهم ذلك.

نعم. لذلك أردت فقط أن أريكم ، وجدت صورة أخرى الليلة الماضية.

وهذا كما ترون كل هؤلاء العلماء القدامى ، أليس كذلك؟

بالطبع ، لم يكن ديفيد يبدو هكذا عندما كان يقوم بعمله.

في الحقيقة ، أعتقد أنه قد تم تنظيفه إلى حد ما هنا.

لقد وجدت هذا في أرشيف كولد سبرينغ هاربور الليلة الماضية.

لقد رأيت صورًا له وهو يبدو أشعثًا إلى حد كبير وربما سيئ السمعة وأشياء أخرى. لكن على أي حال ، عندما كان ديفيد يكتشف كل هذه الاكتشافات كان لا يزال شابًا.

أعتقد أنه حصل على جائزة نوبل عندما كان لا يزال في الثلاثينيات من عمره.

والكثير من هذه الاكتشافات تم إجراؤها بواسطة أشخاص ليسوا أكبر سناً منك. لكن ، مرة أخرى ، يحاول فهم سبب معرفتنا لما نعرفه ثم محاولة تكييف أشياء أخرى فيه. الآن ، الشيء التالي الذي أريد أن أخبركم به عن أنه يحتوي على بعض من هذه الشخصية ، لقد أخبرتك نوعًا ما أن لديك قطعة من الحمض النووي. لنفترض أن هناك جينًا هنا وهذه منطقة الترميز ، ثم نصنع نسخة mRNA ، ثم نستخدم الشفرة الجينية ونصنع البروتين.

وبالتالي إذا قمنا بتسلسل الحمض النووي ووجدنا بداية هذا البروتين يمكننا أن نقرأ مع استخدام هذا الرمز الجيني ويجب أن يذهب بعيدًا.

وقد تم تصميم ذلك وفهمه بشكل جميل ، تمامًا كما انتهيت من إخباركم في ذلك اليوم. إذن فيل شارب الذي حصل على جائزة نوبل لهذا العمل وزميله في قسم الأحياء. إنه في مركز السرطان على الجانب الآخر من الشارع من المبنى الذي أنا فيه. كان هذا هو مركز السرطان الذي أسسه سلفادور لورييه ، الذي تدرب معه جيم واتسون. وكان فيل يدرس هذه العملية. كان ذلك قبل أن نتمكن من تسلسل الحمض النووي. كان ذلك في منتصف السبعينيات.

وكان يعمل بالأدوات التي كنا نحاول بعد ذلك رسمها لعلاقة الحمض النووي الريبي بجين موجود على فيروس.

لقد كان فيروسات DNA ، وليس فيروسات RNA ، لذا لا تختلط مع ذلك. لكن ما كان لديه في الأساس هو جزء من الحمض النووي كان يعرف أنه يشفر الجين. لذلك كان يعلم في مكان ما على هذه القطعة من الحمض النووي أن هناك جينًا في مكان ما هنا ، وقد قام بعزل الحمض النووي الريبي. وإحدى الطرق التي يمكنك من خلالها رسم الخرائط ، أن ترى ماديًا علاقة الحمض النووي الريبي والحمض النووي هي أن نأخذ ، دعنا فقط نأخذ أحد هذه الخيوط.

لذلك لدينا الخيط التكميلي من الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي.

وإذا مزجناها معًا وتركناها تبرد ببطء ، فإنها ستشكل روابط هيدروجينية. سوف يشكلون هجين DNA-RNA بنفس الطريقة التي تظهر بها شريطين من الحمض النووي. ولذا إذا كان الجين أقصر بقليل من قطعة الحمض النووي ، فربما تتوقع أن ترى شيئًا يشبه هذا. والطريقة التي ترى بها هذا ، إذا نظرت في مجهر إلكتروني - ربما سيبدو نوعًا ما مثل هذا. لا يمكنك في الواقع رؤية الخيوط ، لكنك سترى جزءًا سميكًا. سيكون هذا هو ازدواج RNA.

لذلك سيكون هذا مجرد حمض نووي. والجزء السميك هو قاعدة الحمض النووي الريبي المقترنة بشريط واحد من الحمض النووي. لك ذالك؟ هذا ما قالت الكتب المدرسية إنه كان يجب عليك رؤيته. وهذا أكثر من ذلك. هذه بيانات من ورقة فيل تصف ذلك. واسمحوا لي أن أركز على هذا على وجه الخصوص. هذا ما رآه بالفعل.

هل لديكم أي فكرة يا رفاق ما الذي يحدث؟ لماذا لا تأخذ دقيقة ، ابحث عن شخص قريب منك ومعرفة ما إذا كان يمكنك الخروج بأية أفكار. ها هو الهجين. ننسى هذا القليل في نهاية 3 رئيس الوزراء. هذا ليس مصدر قلق. هنا هو الشيء. وهذا ، على ما أعتقد ، هو قطعة من الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل تخرج من النهاية. لكنها تبدو أكثر تعقيدًا بعض الشيء.

أيه أفكار؟ يضع معظم الناس هذه البيانات في أدراجهم.

لم يفعل فيل. لم يفعل فيل وزملاؤه.

ما أدركوه هو أنني سأحاول إعادة رسم هذا بشكل طفيف جدًا لمساعدتك على رؤية ما يحدث.

ما كانوا يرونه كان شيئًا يشبه إلى حد ما ما كانوا يتوقعونه. كانوا يرون منطقة من الحمض النووي الهجين وكانوا يرون منطقة من الحمض النووي أحادي السلسلة مثل هذه ، ولكن ما بدا عليه كان هناك حلقات صغيرة من الحمض النووي أحادي الجديلة تخرج. وما اكتشفه فيل كان ظاهرة نعرفها الآن باسم تضفير الحمض النووي الريبي.

في البكتيريا ، مع استثناءات قليلة جدًا ، يمكنك إلقاء نظرة على الحمض النووي ، ويمكنك العثور على إطار القراءة المفتوح ويمكنك فقط قراءة تسلسل البروتين. تجد ATG ، AUG ، كودون الميثيونين ، ثم يستمر بلا توقف ، وأخيراً تصل إلى توقف كودون وترى أن هناك البروتين. لذا فإن معلومات الترميز مستمرة بشكل أساسي في جميع الجينات البكتيرية تقريبًا.

وهناك عدد قليل ، بعض الجينات من هذا القبيل في حقيقيات النوى ، ولكن العديد من الجينات حقيقية النواة يتم بناؤها ، يبدو الأمر كما لو أنك أخذت الجين الذي وجدته في بكتيريا ثم قطعته في مجموعة من الأماكن وعلقت حمضًا نوويًا إضافيًا بين كل القطع.

لذا ستحصل على شيء مثل هذا حيث يوجد ، في الحمض النووي سيكون هناك معلومات ترميزية.

ثم المعلومات غير المشفرة وكتلة أخرى من معلومات الترميز.

ثم كتلة غير مشفرة وقول واحدة أخرى من معلومات الترميز. لذلك هذا الحمض النووي مزدوج الشريطة.

وما يحدث بعد ذلك عندما تصنع الخلية الحمض النووي الريبي هو أن كل شيء يتم نسخه إلى ما يعرف الآن باسم RNA ما قبل الرسول.

وهناك القليل من عناصر الترميز هنا ، وهناك القليل من عناصر الترميز هنا ، وهناك المزيد من عناصر الترميز هناك. لكن ما تحتويه الخلية يشبه إلى حد ما لقطاتك غير المعدلة من عائلتك الصيفية أثناء إجازتك لكاميرا الفيديو.

وربما لا تريد أن تظهر للجميع ثانية مقطع فيديو التقطته أثناء الحدث. إذن ما تفعله ، تدخل هناك وتقوم بتحريره. في الأيام الخوالي كنت تضطر إلى التقاط الفيلم ولصقه. والآن يمكنكم جميعًا القيام بذلك باستخدام iMovie أو شيء من هذا القبيل. لكن ما تفعله هو أخذ أجزاء المعلومات التي تريدها ، وهذا ما تفعله الخلية.

يأخذ هذا الجزء من الحمض النووي الريبي. وهذا الجزء من الحمض النووي الريبي ، ويربطه معًا ، ثم هذا الجزء. وعندما يتم ذلك يكون لديه mRNA الذي يبدو الآن مثل نوع mRNA الذي ستجده في بكتيريا حيث يمكنك العثور على كودون البداية.

وبعد ذلك يمكنك أن تقرأ بكلمات من ثلاثة أحرف حتى نهاية البروتين. لذا ، في الجوهر ، ما وجده فيل هو أنه في العديد من الكائنات الحية على الأقل هناك خطوة أخرى هنا حيث نحصل على تضفير الحمض النووي الريبي. وفقط بعد ذلك ننتقل إلى البروتينات. ما كان رائعًا جدًا حول هذه النتيجة ولماذا أدق عليها قليلاً هو أن هذه هي البيانات الموجودة في ورقة فيل. يمكنك البحث عنه على الإنترنت.

اكتب Phil Sharp 1977 وستجد هذه الورقة الأصلية مع هذا الرقم بداخلها. في اللحظة التي أدرك فيها فيل ما كان عليه وتحدث عنه في اجتماع ، اكتشف عدد كبير من الناس فجأة نوعًا ما من ربط الحمض النووي الريبي في وقت واحد تقريبًا لأنهم فتحوا أدراجهم وكان هناك كل هذه الصور الإلكترونية الدقيقة غير القابلة للتفسير التي لديهم. وقد تمكنوا في وقت قصير جدًا من حفظه في النظام. كان نفس الشيء يحدث ، لكنه كان محيرًا فقط ، ولم يكن مناسبًا ، وإلى حد ما تم تحديد أذهان معظم الناس من خلال هذا النموذج ، هذه العقيدة المركزية كشيء لا يمكن للمؤمن الحقيقي الشك فيه. وكان يجب أن يكون لديك عقل مرن بما يكفي لتتمكن من رؤية ذلك.

وهذا جزء مهم من علم الأحياء لم يكن متوقعًا.

ويمكن أن يكون رائعًا جدًا. سأعطيكم بعض الأمثلة المتطرفة. حسنًا ، ولا حتى الأمثلة المتطرفة.

ولكن فقط أريكم مقدار المعلومات غير المشفرة التي يمكن أن توجد.

العامل 8 هو بروتين يلعب دورًا في تخثر الدم.

والجين هو 200 زوج كيلوباز. و pre-mRNA هو مجرد نسخة مباشرة ، لذا فهو 200 كيلو قاعدة. إنه مجرد خيط واحد لذا فهو ليس زوجًا أساسيًا. و mRNA المقسم بالفعل عند الانتهاء هو 10 كيلو قاعدة. وهذا يعني أن 5٪ فقط من الجين يقوم بتشفير المعلومات وأن 95٪ من تلك المعلومات يتم التخلص منها عندما يتم تقطيع الحمض النووي الريبي (RNA). وحتى المثال الأكثر تطرفًا هو بروتين يسمى ديستروفين. هذا هو ما يتأثر بمرض وراثي بشري يُعرف باسم الحثل العضلي الدوشيني.

في هذه الحالة ، يكون الجين عبارة عن زوجين من القواعد الضخمة. إذن بالطبع فإن pre-mRNA هو أيضًا قاعدتان ضخمتان لكن الـ pre-RNA هو 16 كيلو قاعدة. لذلك في هذه الحالة أقل من 1٪ من الجين لديه معلومات تشفير لصنع بروتين.

هناك الكثير من الأسباب المثيرة للاهتمام حول سبب حدوث ذلك. أحدها ، يمكن للأشياء أن تتطور بسرعة أكبر في بعض الأحيان لأن لديك أجزاء من البروتينات تشبه نوعًا ما وحدات ويمكن للتطور أن يربط بينها على الأرجح.

في الحقيقة ، إنه يوفر أيضًا طرقًا للتنظيم لأننا نعلم الآن أن هناك طرقًا بديلة لتضفير الحمض النووي الريبي. لذا يمكنك أن تأخذ رنا واحدًا ثم تلصقه بطرق مختلفة في خلايا مختلفة وينتهي بك الأمر بتوليد بروتينات مختلفة تم ترميزها جميعًا بواسطة جين واحد معين. ولذا فهو يعطي الخلايا أنواعًا مختلفة من الاستراتيجيات التنظيمية التي يمكنها استخدامها. الآن ، النوع الثالث من الأشياء التي تندرج في نفس هذا النوع من الأشخاص الذين لديهم أذهانهم منفتحة وغير مثبتة بالفهم الحالي أو مقيدًا بالفهم الحالي هو اكتشاف أن الحمض النووي الريبي يمكن أن يعمل كإنزيم. وقد تحدثت إليكم بالفعل عن ذلك وقلت إنه ريبوزيم ، لكن توم تشيك اكتشفه. يشغل توم حاليًا منصب رئيس معهد هوارد هيوز الطبي ، لكنه قام بعمل ما بعد الدكتوراه في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا مع ماري لو باردو.

لقد كنت في مرحلة ما بعد الدكتوراه في بيركلي عندما كان ينهي للتو عمله في التخرج ، والتقيت به هناك.

ثم جاء إلى معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا لإجراء ما بعد الدكتوراه. وبعد مرور عام ، حصلت على وظيفة لذا أصبحت أصدقاء هناك وأصبحنا أصدقاء عندما بدأنا هنا.

لذلك كان لدي ارتباط وثيق جدًا بهذه القصة بالذات.

إليكم صورة توم مع فيل. هذه في الواقع زوجتي هناك التي كانت في هذه الصورة. لكن توم في الواقع يشبه ذلك كثيرًا. إنه غني بالألوان وممتع للغاية وشخص مثير للاهتمام. ولكن على أي حال ، عندما غادر توم معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا لتولي منصب هيئة التدريس في بولدر ، كان مهتمًا بمحاولة فهم الكيمياء الحيوية لتضفير الحمض النووي الريبي. وهكذا ذهب - لقد فعل ما سيفعله عالم جيد. سيحاولون العثور على نظام تجريبي يكون فيه السؤال الذي يريدون معالجته بسيطًا بما يكفي للحصول على إجابة. هناك طريقة لممارسة العلم حيث تختار نظامًا معقدًا للغاية ولا تحصل على إجابة أبدًا. يبدو الأمر مهمًا للغاية لأنك تعمل على شيء مهم ولكن لا يمكنك ذلك ، فليس لديك الأدوات التي تحتاجها للوصول إلى الإجابة.

لذلك أراد توم العمل على الكيمياء الحيوية لتضفير الحمض النووي الريبي لأن ذلك تم اكتشافه للتو. وهكذا ذهب إلى كائن حي صغير صغير يسمى رباعي الغشاء. والسبب في بحثه لذلك هو أنه يحتوي على RNA ريبوزومي ، لذلك كان RNA تم صنعه بوفرة كبيرة داخل الكائن الحي. وكان بها واحدة فقط من هذه المناطق غير المشفرة. سأخبرك بكلمات هذه الترميز وغير الترميز. إنها ليست بديهية بالنسبة لي ، لكن أعتقد أنه يجب عليك معرفتها.

تسمى منطقة الترميز ، الجزء الذي يرمز إليه يسمى exon والجزء غير المرمز يسمى intron.

لذا ، على أي حال ، عمل توم على هذا الكائن الحي لأنه قبل الرنا المرسال

كان هذا في الأساس. أو ما قبل RNA قبل الربط ، وكلما خرجت إلى Bolder ، كنا نحاول الدخول في لعبة الاسكواش. في أكثر جرأة. وكنا نلعب الاسكواش طوال الوقت. بدا مثل هذا. كان هذا سيعطي هذا مثل

لذلك كنت هناك في اجتماع وكنا جالسين في الخزانة لننمي هذا الكائن الحي. ثم عادوا وكان خارج ذلك. كان بإمكانه الحصول على كميات كبيرة من هذا الحمض النووي الريبي ، لذلك كان جاهزًا للغرفة. وقلت كيف يتم إنتاج الكيمياء الحيوية للتضفير مقتطفات من خلايا هذا الكائن الحي ومن ثم البدء في الطهي هنا. وقد ذهب إلى الدنمارك ، على ما أعتقد ، لمعرفة كيفية القيام بذلك

ركيزة RNA مع جميع أنواع المستخلصات الخلوية. ولذا سمعت عن هذا لأول مرة ، كان توم يعمل على هذا عندما كان ذاهبًا؟ توم يقول ، حسنًا ، الأمور تسير على ما يرام ،

ومن ثم كانت خطته تنقية الإنزيمات التي تقوم بعمل تضفير الحمض النووي الريبي. أعتقد. يقول إن هناك مشكلة صغيرة واحدة فقط.

الضوابط هي الربط. الآن ، ما كان يقصده هو إذا كنت تحاول إضافة مستخلص الخلية والحصول على هذا الشيء الذي ستبدأ به هو الحمض النووي الريبي في الأنبوب بشكل أساسي.

وهذا من شأنه أن يكون سيطرتك. وبعد ذلك تبدأ في إضافة أشياء إليه وتبدأ في البحث عن الربط. وما وجده توم هو أنك إذا أخذت للتو هذا الحمض النووي الريبي وتركته يجلس في أنبوب اختبار ، فقد حدث التضفير دون أن يضع أي شيء فيه. وهنا كان بالفعل للعثور على جميع الإنزيمات ، والبروتينات التي قامت بذلك. And Tom did an absolutely gorgeous piece of science to prove that what was happening was the RNA was catalyzing its own splicing.

And he had to work very, very hard to prove that it wasn't a contaminating protein. Remember we had this sort of discussion? We were talking about is DNA the genetic material and how would we know that it wasn't just a little tiny bit of something else in our DNA perhaps that was doing it. Tom had to go through pretty much a similar exercise, but this was one of these key insights that lead to the proof that RNA could function as a catalyst, what we now know as a ribozyme. And I've shown you now we now sort of accept that the actual ribosome itself is a ribozyme and that the formation of the peptide bond, the thing that's the heart of all proteins is made by a ribozyme, not catalyzed by ribosomes and not by a protein. نعم. So the next topic that I want to try on which sort of we've already set up from this is that if the information is all in DNA to begin with then if you make an RNA copy you're only taking a segment of that information at a time.

And that gives the cells a lot of possibilities for regulating how they respond to the environment or just controlling what genes are expressed. And there are basically two kinds of strategies that are involved in these regulatory decisions. They can either be -- Can either be reversible changes.

For example, a bacterium and a food source. If you're a bacterium and you've got enzymes that let you eat a hundred different kinds of food and you're in an environment where there's only one of them there, you're really wasting energy if you make the proteins to make the other 99. So you might guess that somehow evolution has selected four systems that have learned how to turn on and off the things they need to eat certain food sources depending on whether the food source is available. We only carry umbrellas when it rains. If you had to carry an umbrella and a snowsuit and a surfboard, everything all the time, it would slow you down in evolution.

So the other type, which we've talked about as well when we talked about starting as a single cell and going up to the 14 cells that make us up, then many of those changes, as those cells go along and progressively more specialized need to be irreversible.

And this is particularly important in development. We don't want a cell in our retina suddenly deciding it should be part of a heart and start to make a heart in the middle of your eye or something like that.

So things in development tend to be once you're off you're off or once you're on you're on or something. And just to give you another little look at that picture I've shown you before of the nematode.

And at the time, the first time I showed you this, I was just trying to emphasize that we could take the gene encoding green fluorescent protein and put it in anything and it would go green.

In this case, Barbara Meyer who is at Berkeley now but used to be my office-mate at MIT for many years, what she's done is she's taken that green fluorescent protein, the gene for that, and she's put it under the control of a regulatory system, a gene that is made to be expressed in the esophagus of the worm.

And so even though that gene is present in all the cells of that organism, it's under the control of a system that usually permits the genes to be made that are needed for making esophagus but not in other parts of the body. So you probably didn't pick that part up now but sort of take another look at that same thing and see something different. So how do we learn about gene regulation? The key work, like so many of these things, started kind of inauspiciously, if you will. There were two French scientists, Jacques Monod, who is a biochemist, Francois Jacob who was a geneticist.

And they were working on the metabolism of lactose by E. coli.

Lactose is galactose, beta 1,4 glucose. And you don't have to know exactly the structure. You can just remember there were a lot of different hydroxyls, and that was one particular linkage.

And there's an enzyme that cleaves this into galactose and glucose.

And this can go right into glycolysis and make energy for the organism. And the galactose undergoes a couple of different transformations, and it can get in there as well.

But in order to get at the energy that's in those carbohydrates, this linkage has to be broken. And it was broken by an enzyme called beta-galactosidase. That's a protein that's able to catalyze the cleavage of those two sugars.

That's what Jacques Monod and Francois Jacob were studying.

They were helped out in this exercise. I guess part of the reason they got going on this was people had noticed for many years that if you grew E. coli in glucose there was no beta-gal. I'm going to abbreviate this as beta-gal just so I won't have to keep writing the same thing.

But if they grew E. coli in lactose beta-gal was present.

And they had to be able to assay for this enzyme. And they used -- There were standard types of biochemical assays you could use. But some chemists that helped design a very cleaver kind of substrate that helped them, that could be used in these kinds of studies, and I'll show you one of them. What this enzyme really looks at is it looks at, let's see, galactose. What it sees is sort of the galactose side of this linkage, and then it reaches in and catalyzes the cleavage of what's joined to it. And it turns out not to be specific for whether glucose is on the other side. It can accept substrates that have other things as well. So some chemists made some variants like this. This is a compound that's commonly known as X-gal.

If you talk to it in the lab it's got a longer chemical name.

But what happens if beta-galactosidase is there, it's able to cleave this substrate so you get galactose, which is colorless. But if you get just X, this is colored, but up here this original material is also colorless.

So this is very convenient because if you use a substrate such as this you could put the cells on a plate with this indicator.

And if they are colored, and the color is blue, you'd know they were making beta-galactosidase. And if you don't see a color, you know they're not. There are a variety of ways of assaying for this enzyme. With that I'm just trying to give you a little bit of flavor of one of the different ways that they could assay for it. Now, one of the issues was it looked as though E. coli didn't have any beta-galactosidase activity if lactose was absent when growing a glucose.

And they made it if lactose was present. Well, that would be kind of what you would expect evolution would have figured out how to do, only make the enzyme for metabolizing lactose if the lactose is present, but they had to figure out what the molecular basis of this was. And one of the possibilities was that the protein was made that it was all sort of unfolded, and when the substrate came in then it folded all around it and then it could cleave it. Or another possibility, which would be the kind we're talking about now, is the protein is not made until the lactose is present, and then it makes it new. So they had to figure out, between these two, which of these two was true. When you see the lactose present, is it just beta-galactosidase is already made but it's inactive, or is it being made de novo when you add the lactose? So what they did was they grew cells in glucose plus radioactive C14-leucine for a long time.

So all the proteins -- -- were radioactive. And once they got, that's going for a long time. So every protein being made is radioactive.

Then they add excess unlabeled leucine. So this means that from now on any new proteins that are made will not be radioactive because you're just going to swamp out any radioactive stuff with this.

And they added glucose, excuse me, now they added lactose through the cells. And then they isolated the beta-gal enzyme. It was actually pretty easy to do. It's a huge enzyme and it's a tetramer. So very large. Even in those days it was fairly easy to isolate this enzyme. And then they looked to see is it radioactive? If it's radioactive it was there all along and it's refolded to become the active enzyme.

Or if it had been only after lactose then it would be made de novo in response to it. And what they found was that it was non-radioactive.

Which implied that it was made after you added the lactose.

So they knew then that they were studying a system in which a protein was only made after the cells had experienced a particular growth substrate. And so a lot of work went into figuring out how this system worked. لنرى. We're a little short on time. So I'll tell you what I'll do.

I'll tell you, I'll just put out quickly the mechanics of what they saw, and we'll start in on the regulation on how this works.

And some of you may be able to figure it out.

What we now know is that the gene that encodes beta-galactosidase is in a stretch of DNA that's pretty interesting. It's got three genes.

It's the gene lacZ. This is the gene for beta-galactosidase.

And another gene called lacY and lacZ. There's a promoter.

That's a start signal for transcription.

Remember that? So there's a sequence here that says start transcription. Down here is a terminator.

Another word written in the nucleic acid alphabet that means stop making mRNA. And there is one long mRNA, as you can see, that has the peculiarity of encoding three different genes.

So if you have more than one gene in a single message then that's called an operon.

You've got one mRNA. But, in any case, so whenever beta-galactosidase was being made then RNA has to start being made here, goes to there. And we won't worry about the functions of these other two genes. But, as you might guess from the way evolution has selected for it, they have related activities to what beta-galactosidase does. And for bacteria it's a very efficient way to control the expression of a bunch of genes at once. Then there was another gene up here known as lacI that had a promoter and a terminator, and it made an mRNA as well.

And that mRNA encoded a protein that's known as the lac repressor.

And what that lac repressor does, it's a protein that has the ability to recognize a very, very specific DNA sequence and bind there. And I'm just going to kind of blow up this part of the thing.

So what we have here is the, this is the promoter here. And it happens that the binding sequence -- -- for lac repressor overlaps with the promoter. Weird, right? ربما لا.

So I'll tell you, well, you can think about this over the weekend, if you haven't run into this system before.

So this gene gets made all the time. So this protein gets made all the time. What does that protein do if it's just like this?

Its job in life is to look for this sequence and bind to it.

If it binds to it, it covers up the promoter.

And the beta-galactosidase gene is not expressed because the cell cannot make mRNA. So this may seem a little obscure, but there's something very important here. Now the conditionality on whether this gene is expressed or not is controlled by a protein, right? It's controlled by this lac repressor. If it's on there the gene will be made. And if it's off the gene now you can make it. There's a promoter and the RNA polymerase will see it. And so you've learned something about proteins. They can bind various things.

And so what lac repressor has, it's got a little binding site that lactose is able to bind to and change the confirmation of the lac repressor. So why don't you take those pieces of information and see if you can figure out how the circuitry goes.

نعم؟ Did I do something wrong? آسف. أه آسف. اعذرني. Yes, Z-Y-A. اعذرني. نعم؟ We'll walk through that on Monday, but focus on the fact that if the repressor is there and lactose isn't, it binds to this sequence.

The repressor is made all the time, but this repressor is something that can tell you whether lactose is there or not. So you can put the circuit together, OK?


Organisation and Regulation of Genes in Prokaryotes

Different genes in an organism are meant for synthesis of different proteins which are needed at different times.

Specific enzymes are needed at different times in the life cycle of an organism. However, at all times in the life cycle, every cell contains same set of genes. It is therefore necessary to have mechanisms which would allow only the desired genes to function at a particular time and restrict the activity of other genes. A variety of mechanisms are now known which regulate gene expression at different levels including transcription, processing of mRNA and translation.

Gene Regulation in Prokaryotes:

The rate of expression of bacterial genes is controlled mainly at the level of mRNA synthesis (transcription). Regulation can occur at both the initiation and the termination of mRNA tran­scription.

Regulation of lac operon in E. coli:

Jacob and Monod, two French microbiologists, on the basis of their investigation on E.coli suggested the first model for gene regulation called the operon model in 1961. In this bacterium, there are three enzymes causing the breakdown of the sugar lactose, B-galactosidase, permease and transacetylase.

When E. coli cells are grown on a carbon source other than lactose the inter­cellular levels of these three proteins are extremely low-perhaps 1/1000 of the levels they attain when lactose is present. Lactose is therefore said to be an inducer of these proteins. Early studies established that the induction process involves a de novo synthesis of β-galactosidase and not the activation of some pre-existing enzymes.

Jacob and Monod put forth an operon model to explain such regulation of lactose gene.

There are three structural genes in lac operon which includes the following :

(i) gene lac z(3063 bp) codes for the enzyme P galactosidase, which is active as a tetramer and breaks lactose into glucose and galactose to be utilized in the cell

(ii) gene lac y (800 bp) codes for β galactose permease, which is a membrane bound protein and helps in transport of me­tabolites and

(iii) gene lac a (800 bp) which codes for p galactose transa­cetylase, an en­zyme that transfers an acetyl group from acetyl-CoA to P galactosides.

In sequence with these genes and adjacent to them, there are operator gene which does not code for pro­tein but exercises control over the three structural genes allowing transcription of mRNA for the three enzymes to take place. This is called as operator gene ‘o’.

The promoter gene is located just upstream of the operator and provides the binding site for RNA polymerase which carries out transcription. The operator gene is under the control of yet another segment of DNA called a regulator gene which is situated apart from the operator and structural genes.

The regulator seems to specify a protein called a repressor which binds with the operator gene and, renders it inactive. This prevents the enzymes bound to the promoter from progressing to the structural genes and so transcription cannot occur. The operator, promoter and structural genes together are called an operon.

Occasionally, substances in the cytoplasm called inducer substances may bind with the repressor molecules. In Jacob and Monod’s system it was found that lactose interacts in this manner with the repressor, binding it and allowing the operator gene to ‘switch on’ the structural genes which then produce mRNA that determines the synthesis of enzymes which catalyze the break­down of lactose.

As the lactose is metabolized, repressor molecules are freed, which bind to the operator and transcription of the structural genes ceases, i.e. they are ‘switched off. The operator gene thus serves as a switch mechanism for the entire group of structural genes with which it is associated.

The Repressor:

Repressors produced by regulator genes are proteins which bind to the respective operator genes and has four identical subunits which join to form two symmetrical grooves. Apparently, repressors belong to the group of allosteric proteins which change their shape on interaction with specific molecules.

Since the repressor reversibly binds to both lac DNA and the inducer allolactose, it appears to have two distinct binding sites. In the absence of inducer, the DNA binding site is active and the repressor binds to the lac DNA.

But when allolactose binds to the repressor molecule the DNA binding site is changed to an inactive state, and the repressor can no longer bind to lac DNA. The binding of repressor to lac DNA prevents the transcription of lac genes, while its release from the lac DNA (after its interaction with the inducer) permits their transcription.

The Effectors or Inducers:

The affinity of repressor binding to the operator is regulated by the inducer or co-repressor, small molecules also called effectors. An apparent effector is the compound which appears to act as effector when present in a sufficient concentration.

In many cases, an apparent effector may be changed by the cell to another compound which acts as the effector such an effector is known as the actual effector. For example, lactose is the apparent effector of the lac operon in E. coli, but the actual effector is allolactose.

Negative Control:

In negative control, the association of a specific protein (repressor) with the operator DNA prevents the transcription of the operon. The transcription is believed to be prevented due to a change in the configuration of the operator DNA so that RNA polymerase is unable to perform its function.

Since the regulation of gene action in such a system is achieved by the prevention of transcription by a repressor it is known as negative control. The negative control system is grouped into two categories, (i) inducible and (ii) repressible.

Inducible Negative Control:

In this system, enzyme production begins only in the presence of an inducer (effector), generally the substrate of the concerned metabolic pathway. In the absence of inducer, enzyme production is blocked i.e., the genes of the operon are repressed. The lac operon of E. coli is an inducible operon, and many other operons concerned with substrate utilization show induction.

Repressible Negative Control:

In this system, the operon is normally functional, i.e., depressed, and the concerned enzymes and produced by the cell. The presence of a co-repressor (effector) generally the end-product of the concerned biosynthetic pathway stops the enzyme production, i.e., represses the operon.

The operons concerned with biosynthetic pathways e.g., synthesis of histidine, tryptophan and many other amino acids, etc., show repressible negative control. The regulator gene in this system produces an inactive repressor which is unable to bind to the operator gene.

The inactive repressor, also known as aporepresser, becomes an active repressor only when it binds to the effector mol­ecule. The active repressor attaches the operator gene and prevents the transcription of the operon.

Positive Control:

In positive control of transcription, association of a specific protein, termed as activator to a segment of DNA in the promoter gene or to RNA polymerase enables the transcription of the operon. The promotory effect of the activator is believed to be due to its effect on DNA configuration in the transcription initiator region, which then becomes more favourable for the action of RNA polymerase. The positive control is also either inducible or repressible.

Inducible Positive Control:

In this system, the activator is in an inactive state and is unable to attach to the promoter DNA. The activator binds to the promoter only after it’s interacts with a specific inducer which produces an active activator. The catabolic sensitive operons of E. coli e.g., the operon producing enzymes for the degradation of arabinose (ara) and galactose (gal) provide examples of such a control.

Repressible Positive Control:

In this system, the activator binds to the promoter gene permitting the transcription of operon. An interaction with the effector, a corepressor, changes the configu­ration of the activator so that it is unable to bind to the promoter causing a repression of the operon.


النقاط الرئيسية

A key problem in gene therapy is the lack of a vector system that fulfils all the requirements for safety and efficacy.

Viral vectors are the most promising vectors at this time. Integrating viruses are based on retrovirus, lentivirus and adeno-associated virus. Some vectors are based on adenovirus — a non-integrating virus.

Immunological barriers are a problem for all vectors, but particularly for adenoviral vectors.

The death of Jesse Gelsinger in a gene therapy Phase I clinical trial has overshadowed some recent successes in gene therapy in animal models and notably in humans with a form of severe combined immune deficiency.

The next phase of gene therapy will be focused on targeted and regulated expression of the therapeutic gene.


Expression of proteins with dimethylarginines in Escherichia coli for protein-protein interaction studies

Protein arginine methylation often modulates protein-protein interactions. To isolate a sufficient quantity of proteins enriched in methyl arginine(s) from natural sources for biochemical studies is laborious and difficult. We describe here an expression system that produces recombinant proteins that are enriched in omega-N(G),N(G)-asymmetry dimethylarginines. A yeast type I arginine methyltransferase gene (HMT1) is put on a plasmid under the control of the Escherichia coli methionine aminopeptidase promoter for constitutive expression. The protein targeted for post-translational modification is put on the same plasmid behind a T7 promoter for inducible expression of His(6)-tagged proteins. Sbp1p and Stm1p were used as model proteins to examine this expression system. The 13 arginines within the arginine-glycine-rich motif of Sbp1p and the RGG sequence near the C terminus of Stm1p were methylated. Unexpectedly, the arginine residue on the thrombin cleavage site (LVPRGS) of the fusion proteins can also be methylated by Hmt1p. Sbp1p and Sbp1p/hmt1 were covalently attached to solid supports for the isolation of interacting proteins. The results indicate that arginine methylation on Sbp1p exerts both positive and negative effects on protein-protein interaction.

الأرقام

Plasmid constructed for the expression…

Plasmid constructed for the expression of proteins with dimethylarginines. Sbp1p is the protein…

In vitro methylation of Sbp1p,…

In vitro methylation of Sbp1p, Sbp1p/hmt1, Stm1p, and Stm1p/hmt1. Recombinant proteins after in…

Mass spectrometric analyses of Sbp1p,…

Mass spectrometric analyses of Sbp1p, Sbp1p/hmt1, and their N-terminal fragments. Deconvoluted mass spectra…

Amino acid analysis of Sbp1p…

Amino acid analysis of Sbp1p and Sbp1p/hmt1. The elution profile of amino acid…

MALDI-TOF mass spectra of Sbp1p…

MALDI-TOF mass spectra of Sbp1p ( أ ) and Sbp1p/hmt1 ( ب )…

Identification of the major methylation…

Identification of the major methylation site on Stm1p. Recombinant wild-type Stm1p (lanes 1…

SDS-PAGE analysis of Sbp1p and…

SDS-PAGE analysis of Sbp1p and Sbp1p/hmt1 interacting proteins. Proteins eluted from an Affi-Gel…


Single Vector multiple promoters? - (Sep/09/2008 )

I need to clone two different GPCRs into one vector and use it in transient transfections of HEK cells. In order to optimize transfection efficiency ( I am cloning into a stable cell line that is already stably expressing another GPCR) I would like to keep everything in one vector. It appears the pIRES vectors may be unsuitable as I think you cannot put a stop codon after the first upstream which means adding extra AAs to the upstream receptor insert and my downstream insert would be too large (2.5kB) for efficient expression through the IRES.

Does anyone know of a good vector with two MCS sites that are under the control of independent promoters that can be cloned into E. Coli and expressed in mammalian cells that may be suitable for what I am trying to do?

We have made these type of vectors ourselves. two independent cassettes in one plasmid. These are different viral vectors.

Thanks for the reply. Do you have any info or citations on how these work and how to make them?

I have used human synapsin as both promoters for one vector and for other murine CMV and human synapsin.

There is this other where human CMV was used for both cassettes.

Check this paper from my old lab. [attachment=5277:paper1.pdf]

Thanks for the info- very cool

Do you know if any plasmid vectors exist that use multiple cassettes without using an IRES or if this is even possible?

I have used human synapsin as both promoters for one vector and for other murine CMV and human synapsin.

There is this other where human CMV was used for both cassettes.

Check this paper from my old lab. [attachment=5277:paper1.pdf]

I think having more than 2 casettes is possible. As the vectors I described ofcourse have an ampicillin resistance gene and its promoter. SO basically these have 3 casettes.

Does this answer your question?

Thanks for the info- very cool

Do you know if any plasmid vectors exist that use multiple cassettes without using an IRES or if this is even possible?

Yes, it is most certainly possible. You can even build your own shuttle vector that expresses several genes under different promoters for say S.pombe, caries an 2 S.pombe markers and a E coli marker for selection in e coli.

The only problem you can experience is if you use the same promoter or terminator two or more times. Having repeated structures in your plasmid can cause some problems due to homologous recombination. (especially when working with E coli and yeast)

Thanks for help, much appreciated

Thanks for the info- very cool

Do you know if any plasmid vectors exist that use multiple cassettes without using an IRES or if this is even possible?

Yes, it is most certainly possible. You can even build your own shuttle vector that expresses several genes under different promoters for say S.pombe, caries an 2 S.pombe markers and a E coli marker for selection in e coli.

The only problem you can experience is if you use the same promoter or terminator two or more times. Having repeated structures in your plasmid can cause some problems due to homologous recombination. (especially when working with E coli and yeast)


Alper H, Fischer C, Nevoigt E, Stephanopoulos G (2005) Tuning genetic control through promoter engineering. Proc Natl Acad Sci USA 102:12678–12683

An G, Costa MA, Ha S-B (1990) Nopaline synthase promoter 1S wound inducible and auxin inducible. Plant Cell 2:25–33

Benfey PN, Chua N-H (1990) The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants. Science 250:959–966

Bhullar S, Chakravarthy S, Advani S, Datta S, Pental D, Burma PK (2003) Strategies for development of functionally equivalent promoters with minimum sequence homology for transgene expression in plants: cis-elements in a novel DNA context versus domain swapping. Plant Physiol 132:988–998

Bhullar S, Datta S, Advani S, Chakravarthy S, Gautam T, Pental D, Burma PK (2007) Functional analysis of the cauliflower mosaic virus 35S promoter: re-evaluation of the role of subdomains B5, B4, and B2 in promoter activity. Plant Biotechnol J 5:696–708

Bhullar S, Datta S, Burma PK (2010) Delayed trans-inactivation of synthetic domain A 35S promoters by “Tobacco 271 Locus” due to reduced sequence homology. Plant Mol Biol Rep 29:1–11

Brusslan JA, Karlin-Neumann GA, Huang L, Tobin EM (1993) An أرابيدوبسيس mutant with a reduced level of cab140 RNA is a result of cosuppression. Plant Cell 5:667–677

Cazzonelli CI, Velten EJ (2008) In vivo characterization of plant promoter element interaction using synthetic promoters. Trans Res 17:437–457

Chaturvedi CP, Sawant SV, Kiran K, Mehrotra R, Lodhi N, Ansari SA, Tuli R (2006) Analysis of polarity in the expression from a multifactorial bidirectional promoter designed for high-level expression of transgenes in plants. J Biotechnol 123:1–12

Chung S, Parish RW (2008) Combinatorial interactions of multiple رابطة الدول المستقلة-elements regulating the induction of the أرابيدوبسيس XERO2 dehydrin gene by abscisic acid and cold. Plant J 54:15–29

Comai L, Moran P, Maslyar D (1990) Novel and useful properties of a chimeric plant promoter combining CaMV 35S and MAS elements. Plant Mol Biol 15:373–381

Coutu C, Brandle J, Brown D, Brown K, Miki B, Simmonds J, Hegedus DD (2007) pORE: a modular binary vector series suited for both monocot and dicot plant transformation. Trans Res 16:771–781

Dhadi SR, Krom N, Ramakrishna W (2009) Genome-wide comparative analysis of putative bidirectional promoters from rice, أرابيدوبسيس و Populus. Gene 429:65–73

Ellis JG, Llewellyn DJ, Walker JC, Dennis ES, Peacock WJ (1987) The ocs element: a 16 base pair palindrome essential for activity of the octopine synthase enhancer. EMBO J 6:3203–3208

Ettwiller LM, Rung J, Birney E (2003) Discovering novel رابطة الدول المستقلة-regulatory motifs using functional networks. Genome Res 13:883–895

Evrard A, Ndatimana T, Eulgem T (2009) FORCA, a promoter element that responds to crosstalk between defense and light signaling. BMC Plant Biol 9:1–13

Fang RX, Nagy F, Subramaniam S, Chua NH (1989) Multiple رابطة الدول المستقلة regulatory elements for maximal expression of the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic plants. Plant Cell 1:141–150

Fauteux F, Strömvik MV (2009) Seed storage protein gene promoters contain conserved DNA motifs in Brassicaceae, Fabaceae و Poaceae. BMC Plant Biol 9:126–136

Frey PM, Scharer-Hernandez NG, Futterer J, Potrykus I, Puonti-Kaerlas J (2001) Simultaneous analysis of the bidirectional African cassava mosaic virus promoter activity using two different luciferase genes. Virus Genes 22:231–242

Gatz C, Frohberg C, Wendenberg R (1992) Stringent repression and homogeneous depression by tetracyclin of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants. Plant J 2:397–404

Gilmartin PM, Sarokin L, Memelink J, Chua NH (1990) Molecular light switches for plant genes. Plant Cell 2:369–378

Gowda S, Wu FC, Herman HB, Shepherd RJ (1989) Gene VI of figwort mosaic virus (caulimovirus group) functions in posttranscriptional expression of genes on the full-length RNA transcript. Proc Natl Acad Sci USA 86:9203–9207

Gurr SJ, Rushton PJ (2005) Engineering plants with increased disease resistance: how are we going to express it? Trends Biotechnol 23:283–290

Hammer K, Mijakovic I, Jensen PR (2006) Synthetic promoter libraries—tuning of gene expression. Trends Biotechnol 24:53–55

Hehl R, Wingender E (2001) Database-assisted promoter analysis. Trends Plant Sci 6:251–255

Heise A, Lippok B, Kirsch C, Hahlbrock K (2002) Two immediate-early pathogen-responsive members of the AtCMPG gene family in نبات الأرابيدوبسيس thaliana and the W-box-containing elicitor-response element of AtCMPG1. Proc Natl Acad Sci USA 99:9049–9054

Helden JA (2003) Regulatory sequence analysis tools. Nucl Aci Res 31:3593–3596

Higo K, Ugawa W, Iwamoto M, Korenaga T (1999) Plant رابطة الدول المستقلة-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucl Aci Res 27:297–300

Istrail S, Davidson EH (2004) Logic functions of the genomic رابطة الدول المستقلة-regulatory code. Proc Natl Acad Sci USA 102:4954–4959

Ito M, Iwase M, Kodama H, Lavisse P, Komamine A, Nishihama R, Machida Y, Watanabea A (1998) A novel رابطة الدول المستقلة-acting element in promoters of plant B-type cyclin genes activates M phase–specific transcription. Plant Cell 10:331–341

Jensen PR, Hammer K (1998) The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters. Appl Environ Microbiol 64:82–87

Jiao Y, Lau ON, Deng XW (2007) Light-regulated transcriptional networks in higher plants. Nat Rev Genet 8:217–230

Kamisugi Y, Cuming AC (2005) The evolution of the abscisic acid-response in land plants: comparative analysis of group 1 LEA gene expression in moss and cereals. Plant Mol Biol 59:723–737

Kim Y-H, Bae JM, Huh G-H (2010) Transcriptional regulation of the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene from sweet potato in response to plant developmental stage and environmental stress. Plant Cell Rep 29:779–791

Kovalchuk N, Li M, Wittek F, Reid N, Singh R, Shirley N, Ismagul A, Eliby S, Johnson A, Milligan AS, Hrmova M, Langridge P, Lopato S (2010) Defensin promoters as potential tools for engineering disease resistance in cereal grains. Plant Biotechnol J 8:47–64

Lam E, Lam YKP (1995) Binding site requirements and differential representation of TGA factors in nuclear ASF-1 activity. Nucl Acids Res 23:3778–3785

Last DI, Bretteli RIS, Chamberlain DA, Chaudhary AM, Larkin PJ, Marsh EL, Peacock WJ, Dennis ES (1991) pEmu: an improved promoter for gene expression in cereal cells. Theo App Genet 81:581–588

Leeuwen WV, RuttInk T, Borst-Vrenssen AWM, Plas LHWVD, Krol ARVD (2001) Characterization of position-induced spatial and temporal regulation of transgene promoter activity in plants. J Exp Bot 52:949–959

Lescot M, Dehais P, Thijs G, Marchal K, Moreau Y, Peer YVD, Rouze P, Rombauts S (2002) PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucl Acids Res 30:325–327

Li ZT, Jayasankar S, Gray DJ (2004) Bi-directional duplex promoters with duplicated enhancers significantly increase transgene expression in grape and tobacco. Transgenic Res 13:143–154

Liu Z-B, Ulmasov T, Shi X, Hagen G, Guilfoyle TJ (1994) Soybean GH3 promoter contains multiple auxin-inducible elements. Plant Cell 6:645–657

Logemann E, Hahlbrock K (2002) Crosstalk among stress responses in plants: pathogen defense overrides UV protection through an inversely regulated ACE_ACE type of light-responsive gene promoter unit. Proc Natl Acad Sci USA 99:2428–2432

Maiti IB, Gowda S, Kiernan J, Ghosh SK (1997) Promoter/leader deletion analysis and plant expression vectors with the figwort mosaic virus (FMV) full length transcript (FLt) promoter containing single or double enhancer domains. Transgenic Res 6:143–156

Matys V, Fricke E, Geffers R, ßling EG, Haubrock M, Hehl R, Hornischer K, Karas D, Kel AE, Kel-Margoulis OV, Kloos D-U, Land S, Lewicki-Potapov B, Michael H, Munch R, Reuter I, Rotert S, Saxel H, Scheer M, Thiele S, Wingender E (2003) TRANSFAC: transcriptional regulation, from patterns to profiles. Nucl Acids Res 31:374–378

Mehrotra R, Mehrotra S (2010) Promoter activation by ACGT in response to salicylic and abscisic acids is differentially regulated by the spacing between two copies of the motif. J Plant Physiol 167:1214–1218

Mehrotra R, Panwar J (2009) Dimerization of GT element interferes negatively with gene activation. J Genet 88:257–260

Mehrotra R, Kiran K, Chaturvedi CP, Anjuman S, Lodhi N, Sawant S, Tuli R (2005) Effect of copy number and spacing of the ACGT and GT رابطة الدول المستقلة elements on transient expression of minimal promoter in plants. J Genet 84:183–187

Meyer P, Saedler H (1996) Homology-dependent gene silencing in plants. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47:23–48

Mijakovic I, Petranovic D, Jensen PR (2005) Tunable promoters in systems biology. Curr Opin Biotechnol 16:329–335

Mitra A, Han J, Zhang ZJ, Mitra A (2009) The intergenic region of Arabidopsis thaliana cab1 و سيارة أجرة2 divergent genes functions as a bidirectional promoter. Planta 229:1015–1022

Moore I, Samalova M, Kurup S (2006) Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant J 45:651–683

Ni M, Cui D, Einstein J, Narasimhulu S, Vergara CE, Gelvin SB (1995) Strength and tissue specificity of chimeric promoter derived from octopine and manopine synthase gene. Plant J 7:661–676

Novina CD, Roy AL (1996) Core promoters and transcriptional control. Trends Genet 12:351–355

Odell JT, Nagy F, Chua N-H (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313:810–812

Ordiz MI, Barbas CF-III, Beachy RN (2002) Regulation of transgene expression in plants with polydactyl zinc finger transcription factors. Proc Natl Acad Sci USA 99:13290–13295

Pelham HRB (1982) A regulatory upstream promoter element in the Drosophila Hsp 70 heat-shock gene. Cell 30:517–528

Pietrzak M, Burri M, Herrero J-J, Mosbach K (1989) Transcriptional activity is inducible in the cauliflower mosaic virus 35S promoter engineered with the heat shock consensus sequence. FEBS Lett 249:311–315

Puente P, Wei N, Deng XW (1996) Combinatorial interplay of promoter elements constitutes the minimal determinants for light and developmental control of gene expression in Arabidopsis. EMBO J 15:3732–3743

Roberts GR, Garoosi GA, Koroleva O, Ito M, Laufs P, Leader DJ, Caddick MX, Doonan JH, Tomsett AB (2005) The alc-GR system. A modified alc gene switch designed for use in plant tissue culture. Plant Physiol 138:1259–1267

Römer P, Recht S, Lahaye T (2009) A single plant resistance gene promoter engineered to recognize multiple TAL effectors from disparate pathogens. Proc Natl Acad Sci USA 106:20526–20531

Rushton PJ, Reinstädler A, Lipka V, Lippok B, Somssich IE (2002) Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. Plant Cell 14:749–762

Saha D, Kumar V, Bhat SR, Srinivasan R (2010) Characterization of upstream sequences of the LOJ gene leads to identification of a novel enhancer element conferring lateral organ junction-specific expression in نبات الأرابيدوبسيس thaliana. Plant Mol Biol Rep 28. doi:10.1007/s11105-010-0229-6

Sawant SV, Singh PK, Gupta SK, Madanala R, Tuli R (1999) Conserved nucleotide sequence in highly expressed genes in plants. J Genet 78:1–8

Sawant SV, Singh PK, Madanala R, Tuli R (2001) Designing of an artificial expression cassette for the high-level expression of transgenes in plants. Theor Appl Genet 102:635–644

Sawant S, Kiran K, Mehrotra R, Chaturvedi CP, Ansari SA, Singh P, Lodhi N, Tuli R (2005) A variety of synergistic and antagonistic interactions mediated by رابطة الدول المستقلة-acting DNA motifs regulate gene expression in plant cells and modulate stability of the transcription complex formed on a basal promoter. J Exp Bot 56:2345–2353

Schlabach MR, Hu JK, Li M, Elledge SJ (2010) Synthetic design of strong promoters. Proc Natl Acad Sci USA 107:2538–2543

Sun Q, Gao F, Zhao F, Li K, Zhang J (2010) Identification of a new 130 bp رابطة الدول المستقلة-acting element in the TsVP1 promoter involved in the salt stress response from Thellungiella halophila. BMC Plant Biol 10:90–102

Tittarelli A, Santiago M, Morales A, Meisel LA, Silva H (2009) Isolation and functional characterization of cold-regulated promoters, by digitally identifying peach fruit cold-induced genes from a large EST dataset. BMC Plant Biol 9:121–136

Tiwari SB, Hagen G, Guilfoyle T (2003) The roles of auxin response factor domains in auxin-responsive transcription. Plant Cell 15:533–543

Unger E, Cigan AM, Trimnell M, Xu RJ, Kendall T, Roth B, Albertsen M (2002) A chimeric ecdysone receptor facilitates methoxyfenozide-dependent restoration of male fertility in ms45 maize. Transgenic Res 11:455–465

Vaucheret H, Béclin C, Fagard M (2001) Post-transcriptional gene silencing in plants. J Cell Sci 114:3083–3091

Venter M (2007) Synthetic promoters: genetic control through رابطة الدول المستقلة engineering. Trends Plant Sci 12:118–124

Venter M, Botha FC (2010) Synthetic promoter engineering. Plant Develop Biol Biotechnol Persp 2(4):393–414

Wassenegger M, Heimes S, Riedel L, Sänger HL (1994) RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 76:567–576

Wray GA (1998) Promoter logic. Science 279:1871–1872

Xie M, He Y, Gan S (2001) Bidirectionalization of polar promoters in plants. Nat Biotechnol 19:677–679

Xu L, Ye R, Zheng Y, Wang Z, Zhou P, Lin Y, Li D (2010a) Isolation of the endosperm-specific LPAAT gene promoter from coconut (Cocos nucifera L.) and its functional analysis in transgenic rice plants. Plant Cell Rep 29:1061–1068

Xu W, Yu Y, Ding J, Hua Z, Wang Y (2010b) Characterization of a novel stilbene synthase promoter involved in pathogen- and stress-inducible expression from Chinese wild Vitis pseudoreticulata. Planta 231:475–487

Zavallo D, Bilbao ML, Hopp HE, Heinz R (2010) Isolation and functional characterization of two novel seed-specific promoters from sunflower (Helianthus annuus L.). Plant Cell Rep 29:239–248


شاهد الفيديو: روتين تنظيف البيت الصباحي تنظيم الوقت وترتيب البيتكيف ابقي بيتي نظيف طوال اليوم (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Wolfrick

    أعتذر ، لكن في رأيي أنت لست على حق. أنا مطمئن. يمكنني إثبات ذلك.

  2. Zeroun

    بشكل رائع ، هذا الرأي من القيمة

  3. Sam

    الموقع رائع ، لكنه يبدو وكأنه شيء يجب تعديله.

  4. Raghnall

    في رأيي ، أنت مخطئ. أنا متأكد. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا إلى PM ، سنتحدث.

  5. Assan

    تم تسجيله خصيصا في منتدى للمشاركة في مناقشة هذا السؤال.

  6. Meinyard

    واحد ونفسه ، لانهائي

  7. Shanris

    أعني أنك لست على حق. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في PM ، سنناقش.



اكتب رسالة