معلومة

قيم الإشريكية القولونية لـ [الإنزيمات] و [المستقلبات] والمعدلات الحركية

قيم الإشريكية القولونية لـ [الإنزيمات] و [المستقلبات] والمعدلات الحركية



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في محاولتي إنشاء نموذج استقلابي لـ بكتريا قولونية، لقد وجدت قائمة شاملة من ردود الفعل الأيضية وقياساتها الكيميائية. الذي أستخدمه حاليًا هو بكتريا قولونية نموذج iJO1366 (المزيد هنا). ما لم أجده بعد هو قائمة شاملة لثوابت معدل الحركة المرتبطة بهذه التفاعلات. أحتاج أيضًا إلى مصدر بيانات لتركيزات هذه الإنزيمات والمستقلبات في حالة ثابتة في بكتريا قولونية. أين يمكنني أن أجد معلومات عن التركيزات وثوابت المعدل؟


أنصحك باستخدام SMBL لـ iAF1260 E. Coli مع صندوق أدوات COBRA على MATLAB. يحتوي على جميع الثوابت التي تبحث عنها محسّنة للحالة المستقرة وقد تم اختبارها على نطاق واسع لمحاكاة حذف / طفرة جينات واحدة ومتعددة. حتى إذا كنت تريد التمسك بنموذجك ، فستتمكن من نسخ الثوابت من هناك.

ومع ذلك ، بناءً على ما تفعله ، قد لا تكون راضيًا عن النماذج بأكملها ، نظرًا لأنها معقدة للغاية من الناحية الحسابية بحيث لا يمكن محاكاتها وتحسينها وتؤدي إلى نتائج غير مستقرة حسابيًا ، خاصةً عند محاولة محاكاة آليات التعاون في المستعمرة.


تأثير تأثيرات النظائر الحركية في الدراسات النظيرية لأنظمة التمثيل الغذائي

تستخدم تجارب وسم النظائر (ILEs) بشكل متزايد للتحقيق في أداء أنظمة التمثيل الغذائي. تخضع بعض الإنزيمات لتأثيرات النظائر الحركية (KIEs) التي تعدل معدلات التفاعل اعتمادًا على التركيب النظيري للركيزة (الركائز). لذلك قد تؤثر KIEs على كل من انتشار النظائر من خلال شبكات التمثيل الغذائي وتشغيلها ، وفي النهاية تهدد القيمة البيولوجية لـ ILEs. ومع ذلك ، لم يتم التحقيق في التأثير الفعلي لـ KIEs على التمثيل الغذائي على مستوى النظام.

نتائج

أولاً ، قمنا بتطوير إطار عمل يدمج KIEs في النماذج الحركية والنظيرية لعملية التمثيل الغذائي ، وبالتالي حساب التأثيرات على مستوى النظام على تركيزات المستقلب ، والتدفق الأيضي ، والأنماط النظيرية. بعد ذلك ، طبقنا هذا الإطار لتقييم تأثير KIEs على استقلاب الكربون المركزي لـ الإشريكية القولونية في سياق 13 C-ILEs ، في ظل مواقف مختلفة شائعة في المختبرات. أظهرت النتائج أن تأثير KIEs يعتمد بشدة على إدخال التسمية وعلى المتغير المدروس ولكنه أقل بكثير من المتوقع بشكل حدسي من القياسات على الإنزيمات المعزولة. تظهر القوة العالمية لكل من العملية الأيضية والأنماط النظيرية إلى حد كبير من الخصائص الجوهرية للشبكات الأيضية ، مثل توزيع التحكم عبر الشبكة وتبادل النظائر ثنائي الاتجاه.

الاستنتاجات

توضح هذه النتائج ضرورة التحقيق في تأثير KIEs على مستوى النظام بأكمله ، وتتعارض مع الفرضيات السابقة بأن KIEs سيكون لها تأثير قوي على التوزيعات النظيرية وعلى تحديد التدفق ، وتقوية القيمة البيولوجية لـ 13 C-ILEs. يُعد إطار النمذجة المقترح عامًا ويمكن استخدامه للتحقيق في تأثير جميع متتبعات النظائر (2 H ، 13 C ، 15 N ، 18 O ، إلخ) على مجموعات البيانات النظيرية المختلفة وأنظمة التمثيل الغذائي. من خلال السماح بدمج البيانات النظيرية وبيانات التمثيل الغذائي التي تم جمعها في ظل ظروف ثابتة و / أو غير ثابتة ، قد تساعد أيضًا في تفسيرات ILEs وتسهيل تطوير نماذج حركية أكثر دقة مع تحسين القدرات التفسيرية والتنبؤية.


مقدمة

التباين الخلوي موجود في كل مكان في جميع مجالات الحياة. في الميكروبات ، تُظهر المجموعات النسيليّة تقلبًا ظاهريًا نتيجة لعوامل متعددة مثل التقلبات في البيئة المكروية ، أو العشوائية في التعبير الجيني ، أو التقسيم غير المتماثل عند انقسام الخلية 1،2،3. التباين معترف به جيدًا على مستوى النسخ والترجمة. ومع ذلك ، فإن العديد من الظواهر أحادية الخلية ناتجة عن ظهور حالات استقلابية متميزة داخل مجموعة نسيلية. على سبيل المثال ، يلعب عدم التجانس الأيضي دورًا رئيسيًا في تحمل المضادات الحيوية 4،5،6 ، وامتصاص المغذيات غير المتجانسة 7،8 ، والاختلافات في معدل النمو 9،10. وقد ثبت أيضًا أن تحولات المغذيات يمكن أن تؤدي إلى انقسام السكان إلى مجموعتين 11،12 أو أكثر من 13 مجموعة سكانية فرعية ذات قدرات نمو متميزة. تم وضع نظرية ظهور مجموعات سكانية فرعية كاستراتيجية تحوط للرهان تمنح ميزة تطورية للبقاء في البيئات المعاكسة 4،14.

يتمثل التحدي الرئيسي لتحديد التباين الأيضي في عدم وجود تقنيات لقياس المستقلبات بدقة خلية واحدة 15. على عكس القياسات أحادية الخلية لتعبير البروتين ، والتي تم تطوير أنظمة مراسلة قوية لها 16،17 ، لا يزال تحديد كمية المستقلبات في الخلايا المفردة يمثل تحديًا كبيرًا. تتضمن بعض التقنيات المستخدمة حتى الآن مستشعرات Förster لنقل طاقة الرنين (FRET) ، وعوامل النسخ المستجيبة للأيض 19،20 ، ومستشعرات RNA 21 ، وقياس الطيف الكتلي 22 ، ومع ذلك فإن معظم هذه التقنيات في المراحل الأولى من التطوير 15 . نتيجة لذلك ، عادة ما يتم قياس عدم التجانس الأيضي بشكل غير مباشر عن طريق قياسات الإنزيمات الأيضية أو معدل النمو في الخلايا المفردة 9 ، 12 ، 23.

هدفنا في هذه الورقة هو توصيف عدم التجانس في المستقلبات نتيجة للتعبير العشوائي للإنزيم والحفز. تفترض النماذج الأيضية تقليديًا أن التفاعلات الأنزيمية تتصرف بشكل حتمي على أساس أن كلاً من الإنزيمات والمستقلبات تظهر بأعداد جزيئات عالية 24. ومع ذلك ، فإن البروتينات أحادية الخلية في الإشريكية القولونية تُظهر أن الإنزيمات الأيضية متغيرة مثل أي عضو آخر في البروتين 17 ، بينما تشير بيانات الأيض إلى أن متوسط ​​وفرة المستقلبات تمتد عدة مرات من الحجم 25. تشير مجموعات البيانات القليلة حول وفرة المستقلب أحادي الخلية بالفعل إلى تباين كبير في بعض المستقلبات في بكتريا قولونية 19،26. يلقي مثل هذا الدليل بظلال من الشك على الافتراض التقليدي للاستقلاب باعتباره عملية حتمية بحتة ، مما يشير إلى وجود صلة بين التقلبات في التعبير الإنزيمي والمستقلبات.

تمت دراسة دور التعبير الجيني العشوائي في تقلب البروتين جيدًا 2،3،27،28،29 ، لكن تأثير هذه العشوائية على التفاعلات الأيضية لا يزال أقل فهمًا. قامت العديد من الدراسات النظرية بتحليل تأثير التقلبات في عرض واستهلاك المستقلبات 30،31،32 ، أو انتشار ضوضاء الإنزيم إلى مستقلب 33. ومع ذلك ، على الرغم من الأدلة التجريبية المتزايدة على التأثيرات العشوائية في التمثيل الغذائي ، لا تزال النماذج الرياضية تفتقر إلى التفاصيل الكافية لدمج العمليات المعروفة بتشكيل عدم تجانس البروتين ، مثل التبديل العشوائي للمحفز والانفجار النسخي.

في هذه الورقة ، نقترح نموذجًا لعدم تجانس المستقلب في الخلايا المفردة. يدمج النموذج العشوائية في تحفيز الإنزيم 24 والتعبير 27 ، وهما عمليتان راسختان تمت دراستهما حتى الآن بشكل منفصل. يتضمن نهجنا صياغة عشوائية لمختلف الآليات ذات الصلة في التفاعلات الأنزيمية ، بما في ذلك الحفز القابل للانعكاس ، والتبديل العشوائي لنشاط المروج ، والتقلبات في نسخ mRNA ، واستهلاك المنتج الأنزيمي من خلال عمليات المصب.

نحن نفحص النموذج لمصادر مختلفة من العشوائية باستخدام المحاكاة والحلول التحليلية للتوزيع الثابت للمستقلب. يكشف التحليل عن أنماط معقدة من عدم التجانس تترجم إلى توزيعات ثنائية النسق ومتعددة الوسائط لعدد جزيئات المستقلب. تنشأ هذه الظواهر من التفاعل بين إنزيم منخفض الوفرة ومعلماته التحفيزية. في ظل فصل النطاقات الزمنية النموذجية للتفاعلات الأيضية ، نظهر أنه يمكن تقريب توزيعات المستقلب بدقة بواسطة نموذج خليط بواسون (PMM) عبر مناطق كبيرة من مساحة المعلمة. يمكن تكييف نموذج الخليط بسهولة مع فئة واسعة من نماذج التعبير الجيني ويوفر أداة كمية للتنبؤ بتقلب المستقلب من قياسات الإنزيم في الخلايا المفردة.


رؤى هيكلية وحركية لتحفيز تدهور الحمض النووي الريبي المعتمد على RppH بواسطة إنزيم التمثيل الغذائي DapF

مهم بشكل حيوي للتحكم في التعبير الجيني في حقيقيات النوى وبدائيات النوى ، يتم التحكم في نزع الحماية لـ mRNA 5 'termini بواسطة الإنزيمات التي يتم تعديل نشاطها من خلال التفاعلات مع العوامل المساعدة. في Escherichia coli ، يبدأ تدهور mRNA المعتمد على 5'- نهاية بتوليد أحادي الفسفرة 5 'termini بواسطة RNA pyrophosphohydrolase RppH ، والذي يمكن تحفيزه بواسطة DapF ، وهو عبارة عن إبيميريز ثنائي أمينوبيميلات يشارك في تخليق الأحماض الأمينية وجدار الخلية. لقد حددنا الهياكل البلورية لمجمعات RppH-DapF وقياس معدلات عدم حماية الحمض النووي الريبي. تظهر هذه الدراسات أن DapF يقوي نشاط RppH بطريقتين ، اعتمادًا على طبيعة الركيزة. يتطلب تأثيره التحفيزي على تفاعل الحمض النووي الريبي diphosphorylated ، الركائز الطبيعية السائدة لـ RppH ، ركيزة طويلة بما يكفي للوصول إلى DapF في المجمع ، بينما يبدو أن التفاعل المعزز للـ RNAs ثلاثي الفسفرة يشتمل على تغييرات يسببها DapF في RppH نفسه ويزيد أيضًا مع طول الركيزة. توفر هذه الدراسة أساسًا لفهم العلاقة المعقدة بين التمثيل الغذائي الخلوي واضمحلال الرنا المرسال وتكشف عن أوجه تشابه مذهلة مع تحفيز نشاط قطع الخلايا في حقيقيات النوى.

الأرقام

أوجه التشابه بين تدهور mRNA المعتمد على 5′ ...

أوجه التشابه بين مسارات تدهور الرنا المرسال المعتمدة على 5′ في حقيقيات النوى و بكتريا قولونية . في…

الهيكل البلوري لـ إي ...

الهيكل البلوري لـ بكتريا قولونية مركب RppH – DapF في شكل apo مع ...

التركيب البلوري لـ RppH ...

التركيب البلوري لـ RppH ر -DapF م مغاير غير متجانسة منضمة إلى ppcpAGU RNA. ...

واجهة RppH – DapF. ( أ…

واجهة RppH – DapF. ( أ ) واجهة بين RppH ر (أخضر) و DapF ...

ألفة ربط غير متجانسة لـ RppH ...

ألفة ربط غير متجانسة لـ RppH و DapF. ( أ ) استبعاد حجم اللوني…

تحديد التفاعلات التعددية المحتملة ...

تحديد التفاعلات الخيفية المحتملة لـ DapF مع RppH. ( أ ) تأثير…

تحفيز DapF لتفاعل RppH ...

تحفيز DapF لتفاعل RppH مع ركائز RNA diphosphorylated. ( أ ) عامل…

تحفيز DapF لتفاعل RppH ...

تحفيز DapF لتفاعل RppH مع ركائز RNA ثلاثية الفسفرة. ( أ ) عامل…

تأثير DapF على تفاعل RppH مع نعم مرنا. ( أ…

أوجه التشابه بين عدم حماية الحمض النووي الريبي 5′-terminal ...

أوجه التشابه بين مجمعات نزع الحماية من الحمض النووي الريبي 5′-terminal في البكتيريا وحقيقيات النوى. ( أ )…


الانتماءات

قسم الكيمياء ومعهد لويس سيجلر لعلم الجينوم التكاملي ، جامعة برينستون ، برينستون ، نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية

Bryson D Bennett و Elizabeth H Kimball و Melissa Gao و Joshua D Rabinowitz

جينوماتيكا ، إنك ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

روبن أوسترهوت وأمبير ستيفن جيه فان دين

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

ب. أجرى تجارب ، حلل البيانات وكتب الورقة. E.H.K. و م. إجراء التجارب. ر. و S.J.V.D. أجرت TMFA. J.D.R. حلل البيانات وكتب الورقة.

المؤلف المراسل


أساليب

نطاق النموذج والبناء الأولي للمجموعة

نموذج التمثيل الغذائي بكتريا قولونية يتكون التمثيل الغذائي من 457 تفاعلًا و 337 مستقلبًا (انظر الشكل 1 أ والبيانات التكميلية 1). يفسر هذا النموذج جميع ردود الفعل من مقياس الجينوم أنانموذج AF1260 27 الذي يحمل التدفق في ظل الظروف التجريبية لقياسات التدفق باستثناء عديد السكاريد الدهني والتخليق الحيوي للمورين. وتشمل هذه التفاعلات في تحلل السكر / استحداث السكر ، ومسار PP ، ودورة TCA ، والتفاعلات اللاصقة ، وتخليق / تحلل الأحماض الأمينية ، وأكسدة / تخليق الأحماض الدهنية ، وعدد من التفاعلات في أجزاء أخرى من عملية التمثيل الغذائي ، مثل العامل المشترك والكربون البديل التمثيل الغذائي والدهون الغشائية وتكوين غلاف الخلية ومسارات الفسفرة المؤكسدة (انظر الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخراج 295 تفاعلًا تنظيميًا من BRENDA 24 و EcoCyc 25 وتم تضمينها في النموذج من خلال إدخال تفاعلات تنظيمية جديدة (انظر الشكل 1 ج) (انظر البيانات التكميلية 1 للحصول على قائمة شاملة). نسخة مبسطة من معادلة الكتلة الحيوية لـ بكتريا قولونية الموصوفة في (المرجع 54) تم دمجها أيضًا في النموذج بما في ذلك جميع الأحماض الأمينية بالإضافة إلى السلائف الأخرى المكونة للكتلة الحيوية في التمثيل الغذائي المركزي. تم استخدام معادلة الكتلة الحيوية هذه فقط "لتصريف" سلائف الكتلة الحيوية من المسارات الغائبة في k-ecoli457 (انظر الشكل 1).

بعد إجراء EM 19 ، تم تحليل جميع التفاعلات الأيضية والتفاعلات التنظيمية في النموذج أولاً إلى خطواتها الأولية وتم تطوير حركة حركية جماعية لكل تفاعل أولي. تم بعد ذلك التعبير عن المعلمات الحركية الأولية من حيث معاملات التفاعل الأولية ، وقابلية التفاعل ص وكسور الإنزيم ، كلاهما مقيد بين صفر وواحد. تُعرَّف قابلية رد الفعل بأنها المعدل الأولي للتفاعل المتخلف مقسومًا على رد الفعل الأمامي لكل خطوة أولية (حيث الخامسصافي هو التدفق الصافي للتفاعل). يتم تعريف جزء الإنزيم على أنه مستوى الإنزيم غير المرتبط ه تم تطبيعه من خلال المجموعة الكلية للإنزيم المحدد (و). تم أيضًا تطبيع تركيزات المستقلب باستخدام قيم السلالة المرجعية (النوع البري). توفر التمثيلات الحركية الأولية وتركيزات المستقلب المتدرجة مقياسًا مناسبًا بين صفر وواحد لأخذ عينات المعلمة لكسور الإنزيم وانعكاسات التفاعل المتوافقة مع مبادئ الديناميكا الحرارية 19. استخدمنا بيانات التدفق المقاسة تجريبياً لنوع بري بكتريا قولونية سلالة تنمو بشكل هوائي مع الجلوكوز 20 باعتباره السلالة المرجعية لتحجيم المجموعة والبناء.

تم الحصول على توزيع التدفق المرجعي من خلال زيادة محصول الكتلة الحيوية إلى الحد الأقصى (لكل 100 مليمول جم DW - 1 ساعة -1 من امتصاص الجلوكوز و 200 ملي مول جم DW - 1 ساعة -1 من امتصاص الأكسجين) في أنانموذج AF1260 باستخدام FBA أثناء فرض قياسات التدفق التجريبية (لـ 43 تفاعلًا) 20 كقيود. بعد ذلك ، تم استخدام تحليل تقلب التدفق 55 لتحديد نطاقات التدفق للتفاعلات بدون قياسات تجريبية عند تثبيت تدفق الكتلة الحيوية بالقيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة الأولى. ثم تم استخدام نطاقات التدفق التي تم الحصول عليها لتقييد التفاعلات دون القياسات المتاحة. ثم تم الحصول على توزيع تدفق مجدي من خلال فرض البيانات التجريبية جنبًا إلى جنب مع نطاقات التدفق المدفوعة بتحليل تقلب التدفق في نموذجنا من خلال تعظيم إنتاجية الكتلة الحيوية. تم بعد ذلك استخدام توزيع التدفق هذا لترسيخ تدفقات الحالة المستقرة أثناء أخذ العينات المنتظم لمعلمات النموذج وبناء المجموعة الحركية الأولية. استخدمنا حجم مجموعة من 2 17 = 131،072 نموذجًا ، حيث لم يتم تحقيق أي تحسن في تنبؤات النموذج والتقارب مع الحل الأمثل لحجم أكبر للمجموعة.

مجموعات بيانات التدفق المتعددة لتحديد معلمات النموذج

تم إجراء معلمات النموذج باستخدام بيانات تدفق الحالة المستقرة لـ 25 سلالة متحولة من بكتريا قولونية تحت الظروف الهوائية واللاهوائية مع ركائز الكربون المتعددة. على وجه الخصوص ، تتضمن مجموعات بيانات التدفق تسعة عشر سلالة متحولة بالضربة القاضية الفردية تنمو في ظل ظروف هوائية (أي ، Δpgi ΔpykA ΔpykF ΔppsA ، Δgnd Δzwf Δrpe ΔpfkA ، ΔpfkB ، ΔfbaB ، ΔgpmA ، ΔgpmB ، Δpgl ، ΔrpiA ، ΔrpiB ، Δتالا، Δطالب ΔtktA و ΔtktB) 20 وسلالتان تنموان في ظل ظروف لاهوائية (أي ، من النوع البري و Δldh) مع الجلوكوز باعتباره الركيزة الكربونية 21 ، ثلاث سلالات تنمو في ظروف هوائية مع البيروفات كركيزة كربونية (أي النوع البري ، Δzwf و Δgnd) 22 وسلالة واحدة تنمو في ظروف هوائية مع الأسيتات باعتبارها الركيزة الكربونية (أي النوع البري) 23. في المجموع ، استخرجنا قياسات التدفق لتفاعلات 30 في كل سلالة متحولة بما في ذلك التفاعلات الرئيسية داخل الخلايا في تحلل السكر ومسار PP ودورة TCA (انظر الشكل 1 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تحليل اقتران باستخدام بكتريا قولونية تفاعل الكتلة الحيوية 56 لزيادة مجموعة بيانات التدفق إلى ما وراء تلك الموجودة في التمثيل الغذائي المركزي. وجدنا أن ما بين 33 و 36 تفاعلًا (اعتمادًا على الطفرة المحددة) كانت مقترنة تمامًا بإنتاج الكتلة الحيوية وتمت إضافتها إلى قائمة التدفقات المقاسة. لم يكن من المستغرب أن تكون هذه التفاعلات موجودة في مسارات التخليق الحيوي لمكونات الكتلة الحيوية ، مثل استقلاب غلاف الخلية ومسارات تخليق الأحماض الأمينية (أي ، ثريونين ، ليسين ، ميثيونين ، فالين ، ليسين ، إيزولوسين ، تيروسين ، تريبتوفان ، فينيل ألانين ، استقلاب الهيستيدين) ( انظر البيانات التكميلية 1).

فترات الثقة للمعلمات المقدرة والمقاسة

تم توفير فترات الثقة فقط للتدفقات المقاسة للسلالة من النوع البري في مجموعات بيانات التدريب 20. وبالتالي ، استخدمنا نفس فترات الثقة التي تم الإبلاغ عنها لكل تفاعل في سلالة من النوع البري لإنشاء نطاق تدفق (أي فاصل ثقة 1 ثانية) حول القيم المبلغ عنها في سلالات متحولة. وبالمثل ، بالنسبة إلى المستقلبات التي ليس لها نطاق ثقة مُبلغ عنه في السلالات المتحولة ، استخدمنا نفس فترات الثقة التي تم الإبلاغ عنها لكل مستقلب في سلالة من النوع البري لإنشاء نطاق تركيز (أي ، فاصل الثقة 1 ثانية). بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لثوابت ميكايليس مينتين التي تم قياسها تجريبياً (أي ، كم و كقط) مع قيم متعددة تم الإبلاغ عنها في BRENDA 24 و EcoCyc 25 ، تم حساب فترات الثقة باستخدام 1 sd. من متوسط ​​قيم المعلمات المبلغ عنها. بالنسبة للمعلمات ذات القيمة المقاسة الفردية فقط ، استخدمنا نطاقًا بنسبة 10 ٪ من قيم المعلمات المبلغ عنها كفواصل ثقة (انظر البيانات التكميلية 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحجيم تركيزات المستقلب الطبيعية المتوقعة وثوابت Michaelis-Menten من خلال نطاقات ثقة تركيز المستقلب المقابلة في السلالة المرجعية (النوع البري) لتحويلها إلى نطاقات فعلية (انظر الطرق التكميلية ، تحويل المعلمات الحركية الأولية المقدرة) . لتقليل عدم اليقين في التركيزات الأساسية ، قمنا باستخراج سبع مجموعات بيانات تركيز مقاسة إضافية للسلالة من النوع البري بالإضافة إلى بيانات السلالة المرجعية واستخدمنا تقاطعات نطاق الثقة الخاصة بهم كنطاقات أساسية 16،28،33،57،58 ، 59،60 (انظر الجدول التكميلي 2). بالنسبة إلى المستقلبات التي لا تحتوي على بيانات تركيز في السلالة البرية (أي 12٪) ، استخدمنا النطاقات المبلغ عنها في أناطراز AF1260 من بكتريا قولونية 27. بعد ذلك ، يتم قياس جودة الاتفاقية على أنها تداخل بين نطاقات الثقة المبلغ عنها والمتوقعة.

تقدير معلمات k-ecoli457

تم إجراء معلمات النموذج على مرحلتين: (أ) تقدير المعلمات الحركية الأولية ونشاط الإيزوزيم باستخدام بيانات التدفق المقاسة تجريبياً لطفرات الضربة القاضية المفردة التي تنمو في ظروف الحد الأدنى من الجلوكوز الهوائية (أي ما مجموعه تسعة عشر مجموعة بيانات تدفق) و (ب) تقدير مستويات الإنزيم في ظل أدنى ظروف تخمر الجلوكوز (اللاهوائية) وركائز الكربون البديلة البيروفات والأسيتات (أي ما مجموعه ست مجموعات بيانات التدفق).

تقدير المعلمات الحركية الأولية ونشاط الإيزوزيم

تم استخدام تطبيق GA الذي قلل من انحراف تنبؤات النموذج عن قياسات التدفق المتاحة لتسع عشرة سلالة متحولة نمت بشكل هوائي باستخدام الجلوكوز 15. في الأساس ، يحدد هذا النهج القائم على التحسين التركيبة المثلى للمعلمات التي تم أخذ عينات منها وبالتالي المكافئ كم و الخامسالأعلى القيم في وصف Michaelis-Menten عن طريق تبديل المعلمات للتفاعلات المختلفة عبر النماذج في المجموعة. يتم التقاط نتيجة خروج خروج الإنزيم من خلال تثبيت إجمالي مستوى الإنزيم الطبيعي إلى الصفر (أي) للتفاعل المحذوف ، بينما يُفترض أن يظل دون تغيير بالنسبة للتفاعلات المتبقية. بالنسبة للتفاعلات المحفزة بواسطة الإنزيمات ، فإن حذف أحد الإنزيمات يقلل (الإنزيم الكلي) إلى مستوى بين الصفر والمستوى المرجعي (أي ،) ، لأنه ليس من الواضح إلى أي مدى يمكن أن يكمل الإنزيم المتبقي للنشاط المفقود. لذلك ، سمحنا بتقليل تنبؤات النموذج بالقياسات التجريبية للوصول إلى أفضل قيمة مع الحفاظ على مجموع كل الإنزيمات إلى واحد. في المجموع ، سمحنا لمستويات الإنزيم الطبيعية لسبعة تفاعلات محفزة بواسطة 12 إيزوزيمًا بالتنوع (أي ، ΔpfkA ، ΔpfkB ، ΔfbaB ، ΔgpmA ، ΔgpmB ، Δpgl ΔrpiA ، ΔrpiB ، Δتالا، Δطالب ΔtktA و ΔtktB تحت الظروف الهوائية مع الجلوكوز باعتباره الركيزة الكربونية) خلال الخطوة الأولى (انظر الطرق التكميلية ، تنفيذ GA).

تقدير مستويات الانزيم

عند تحديد المعلمات الحركية الأولية المقدرة (أي ، كم) ، قمنا بعد ذلك بتقدير السلالات المتحولة التي تنمو بشكل لا هوائي وتلك التي تحتوي على البيروفات أو الأسيتات كركيزة الكربون ، بشكل منفصل. نلاحظ أن هذا يعادل التقدير الخامسالأعلى () في وصف Michaelis – Menten ، أثناء التثبيت كم للقيم المقدرة (انظر الطرق التكميلية ، تنفيذ GA). هذا لأننا توقعنا أن مستويات الإنزيم فقط هي التي من المرجح أن تتغير بشكل كبير عندما يتم تحويل النمو من الهوائية إلى اللاهوائية أو إلى الركيزة الكربونية البديلة 61،62،63. لذلك ، تم السماح لجميع التفاعلات في النموذج بالتنوع من صفر (أي الحذف) إلى تعبير زائد بمقدار 10 أضعاف (أي) لسلالات متحولة تنمو (1) بشكل لا هوائي مع الجلوكوز (أي مجموعتان من بيانات التدفق ) ، (2) هوائيًا مع البيروفات باعتباره الركيزة الكربونية (أي ثلاث مجموعات بيانات تدفق) و (3) هوائيًا مع الأسيتات (أي مجموعة بيانات تدفق واحدة). تم الاحتفاظ بالعدد الإجمالي للأنزيمات التي سُمح بتغير مجموعها الطبيعي كحد أدنى لتجنب زيادة المعامل النموذجية (انظر الطرق التكميلية ، تغييرات مستوى الإنزيم).

تقييم الغلة المتوقعة للإفراط في إنتاج المسوخ

قمنا بتنفيذ تغييرات مستوى الإنزيم من خلال السماح للمجموعة الكلية من الإنزيم الطبيعي بالتنوع بين تنظيم تنازلي بمقدار 10 أضعاف ومستوى النوع البري () للتنظيمات الخافضة للإنزيم المُبلغ عنها. بالنسبة لتنظيمات الإنزيم ، تم ضبط مستوى الإنزيم الطبيعي بين مستوى النوع البري وتنظيم زيادة بمقدار 10 أضعاف (). تم استخدام هذا التقريب لأن مستوى تغيير الإنزيم غالبًا ما يكون غير متوفر في الأدبيات ذات الصلة. تم تنفيذ عمليات حذف الجينات عن طريق ضبط الإنزيم المشفر على صفر.

تحديد معاملات نموذج المربعات الصغرى وتحليل الغلة

الوظيفة الموضوعية لمشكلة المعلمات ض هو تقليل الانحراف النسبي للتدفق المتوقع لـ k-ecoli457 الخامسي من البيانات التجريبية للتفاعل ي مع البيانات المقاسة ن عبر جميع السلالات الطافرة م. لكل تفاعل مع بيانات التدفق المقاس ، يتم قياس متوسط ​​الخطأ النسبي بواسطة معامل التباين الخاص به السيرة الذاتيةي لالتقاط عدم اليقين المبلغ عنه في البيانات التجريبية (متوسط ​​الانحراف النسبي المقياس) 64. نتيجة لذلك ، فإن ردود الفعل ذات فترات الثقة الأكثر إحكامًا لها مساهمة أكبر في الوظيفة الموضوعية.

عائد المنتج ذ يُعرَّف بأنه معدل التفاعل الذي ينتج المنتج لكل معدل تفاعل امتصاص (جزيء المنتج لكل جزيء جلوكوز).

بالنسبة للمقارنات ، ذكرت غالبية الدراسات التجريبية فقط إنتاجية المنتج المقاسة مع عدم وجود نطاق ثقة. وبالتالي ، تم حساب الخطأ لكل منتج على أساس الانحراف النسبي بين المقاس ذ إكسب وتوقع ذ قبل القيم.

تم حل جميع مشاكل المعلمات باستخدام تطبيق GA. تم تنفيذ جميع الحسابات ، بما في ذلك إنشاء المجموعة ومشكلات GA ، في MATLAB (MathWorks Inc.) وتم حلها بالتوازي على ثلاث عقد من Intel Xeon E5-2670 v2 مع 2.5 جيجاهرتز (20 مركزًا لكل عقدة و 256 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي) على مجموعات ولاية بنسلفانيا Lion-X. استغرقت المعلمات k-ecoli457 ∼ 58800 وحدة المعالجة المركزية في الساعة. يستغرق أيضًا تكامل k-ecoli457 (أي حل نظام المعادلات التفاضلية العادية) لحالة أيضية معينة ما يصل إلى بضع دقائق. تتوفر المعلمات الحركية الأولية المقدرة بالإضافة إلى مصفوفة القياس المتكافئ للنموذج في البيانات التكميلية 1 ويتوفر k-ecoli457 القابل للتنفيذ للتنزيل في http://www.maranasgroup.com كملف MAT (MathWorks Inc. ).

توافر الكود

يعلن المؤلفون أن الكود الذي يدعم نتائج هذه الدراسة متاح في ملفات المعلومات التكميلية للمقال () وعلى http://www.maranasgroup.com كملف MAT (MathWorks Inc.).

توافر البيانات

يتم تضمين جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها خلال هذه الدراسة في هذه المقالة المنشورة وملفات المعلومات التكميلية الخاصة بها.


المواد والأساليب

التسلسل الجينومي للسلالة.

تم عزل الحمض النووي الجيني للنسخ المستنسخة لنقطة النهاية ALE باستخدام تقليب الخرزة في 96 طبقًا جيدًا كما هو موضح سابقًا (31). تم إنشاء مكتبات تسلسل الحمض النووي للجينوم الكامل المقترنة مع مجموعة إعداد مكتبة Kapa HyperPlus (Kapa Biosystems) وتشغيلها على منصة Illumina HiSeq 4000 مع مجموعة HiSeq SBS ، 150 زوجًا أساسيًا يقرأ. تمت معالجة ملفات fastq لتسلسل الحمض النووي التي تم إنشاؤها باستخدام خط أنابيب breseq الحسابي (الإصدار 0.32.0) (32) ومواءمتها مع بكتريا قولونية الجينوم المرجعي K12 MG1655 (33) لتحديد الطفرات. تم إنجاز مراقبة جودة تسلسل الحمض النووي باستخدام برنامج AfterQC (الإصدار 0.9.7) (34).

تم اختيار الحيوانات المستنسخة من أجل تمثيل الأليلات عالية التردد الموجودة في مجموعات نقاط النهاية لتجارب ALE ذات الصلة. تم استخدام تسلسل الحمض النووي لإنشاء بروتينات مرجعية لتجارب البروتينات الموضحة أدناه.

إعداد عينة.

لكل سلالة ، نمت 3 مل من الثقافة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج في وسط M9 (4 جم من الجلوكوز لتر -1) (35) مع العناصر النزرة (36) ، ثم مرت مرتين في الأيام التالية في 15 مل من الوسائط عند 37 درجة مئوية من الكثافة البصرية (OD) 0.05 إلى 0.1 إلى OD 1.0 إلى 1.5. للتجربة ، 100 مل من الثقافة مع OD الأولي600 (OD بطول موجة 600 نانومتر) = 0.1 نمت في قوارير مع التحريك في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. عندما وصلت الثقافات إلى OD600 = 0.6 ، تم جمع 40 مل من الثقافة ووضعها على الفور على الجليد. تم تكوير الخلايا بواسطة جهاز طرد مركزي عند 5000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تم بعد ذلك غسل حبيبات الخلايا باستخدام 20 مل من محلول ملحي بارد بالفوسفات البارد (PBS) ثلاث مرات وطرده عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم نقل الكريات إلى أنابيب طرد مركزي بسعة 1.5 مل وطردها عند 8000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تمت إزالة المخزن المؤقت المتبقي من PBS ، وتم تجميد كريات العينات البروتينية عند -80 درجة مئوية.

عينة تحلل للبروتيوميات.

تم غمر العينات المجمدة في محلول تحلل يحتوي على 75 ملي مولار كلوريد الصوديوم (سيغما الدريتش) ، 3٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (فيشر العلمية) ، 1 ملي مولار فلوريد الصوديوم (VWR International ، LLC) ، 1 ملي مولار- جليسيروفوسفات (سيغما الدريتش) ، 1 ملي مولار. orthovanadate الصوديوم ، 10 ملي بيروفوسفات الصوديوم (VWR International ، LLC) ، 1 ملي فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (فيشر العلمية) ، 50 ملي مولار هيبس (فيشر العلمية) درجة الحموضة 8.5 ، و 1 × خليط مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من حمض الإيثيلين. تم إخضاع العينات لخلط سريع ومسبار صوتنة باستخدام Q500 QSonica sonicator (Qsonica) المجهز بطرف دقيق 1.6 مم بسعة 20 ٪. تم إخضاع العينات لثلاث دورات من 10 ثوانٍ من صوتنة تليها 10 ثوانٍ من الراحة ، مع زمن صوتنة إجمالي قدره 50 ثانية.

كمية وفرة البروتين.

تم تحديد وفرة البروتين الكلي باستخدام مجموعة فحص البروتين لحمض البيسينشونينيك (بيرس) على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.

عزل الببتيد.

تم اقتطاع ستة ملليغرام من البروتين لكل عينة. تم إحضار حجم العينة حتى 20 مل في محلول 4 M Urea + 50 mM Hepes ، الرقم الهيدروجيني = 8.5. تم تقليل روابط ثاني كبريتيد في 5 ملي ديثيوثريتول (DTT) لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية. تمت ألكلة روابط ثاني كبريتيد المختزلة في 15 ملي مولار من يودواسيتاميد في بيئة مظلمة بدرجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. تم إخماد تفاعل الألكلة عن طريق إضافة الحجم الأصلي من DTT لمدة 15 دقيقة في بيئة مظلمة عند درجة حرارة الغرفة. تم ترسيب البروتينات بعد ذلك من المحلول عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 100٪ وزن / حجم حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. تم خلط العينات واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق. تم إخضاع العينات للطرد المركزي عند 16000 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تمت إزالة المادة الطافية وغُسلت حبيبات العينة برفق في 50 ميكرولتر من الأسيتون المثلج. بعد خطوة الغسيل ، تم إخضاع العينات للطرد المركزي عند 16000 × ز عند 4 درجات مئوية. تم تكرار غسل الأسيتون ، وتمت إزالة المادة الطافية النهائية. تم تجفيف كريات البروتين على كتلة تسخين عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتم تعليق الكريات في محلول من 1 M Urea + 50 ملي مولار Hepes ، درجة الحموضة = 8.5. تم إعادة تشكيل معيار UPS2 (Sigma) على النحو التالي. تمت إضافة عشرين مليلترًا من محلول 4 مولار يوريا + 50 ملي مولار Hepes ، الرقم الهيدروجيني = 8.5 إلى الأنبوب. تعرض أنبوب العينة إلى صوتنة دوامة وحمام مائي لمدة 5 دقائق لكل منهما. تعرض المعيار للاختزال والألكلة باستخدام الطرق الموضحة أعلاه. تم تخفيف العينة بعد ذلك في محلول 50 ملي مولار Hepes ، ودرجة الحموضة = 8.5 بحيث كان التركيز النهائي لليوريا 1 م. ثم تم دفع 0.88 مجم من البروتين القياسي في كل عينة تجريبية ، وتم إخضاع العينات لخطوتين. عملية الهضم. أولاً ، تم هضم العينات باستخدام 6.6 ميكروغرام من LysC في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ، مع الاهتزاز. بعد ذلك ، تم هضم البروتين في 1.65 ميكروغرام من التربسين المتسلسل (Promega) لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية. تم إنهاء تفاعلات الهضم عن طريق إضافة 3.3 ميكرولتر من 10٪ حمض ثلاثي فلوروأسيتيك (TFA) ، وتم رفعها إلى حجم عينة 300 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. تم إخضاع العينات للطرد المركزي عند 16000 × ز لمدة 5 دقائق وتحلية بأعمدة تحلية معبأة في المنزل باستخدام طرق مقتبسة من الدراسات المنشورة مسبقًا (37 ، 38). بعد التحلية ، تم تجميد العينات بالتجميد ، ثم تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

LC-MS / MS.

تم إعادة تعليق العينات في محلول مكون من 5٪ أسيتونيتريل (ACN) و 5٪ حمض الفورميك (FA). تم إخضاع العينات إلى صوتنة قوية ودوامة حمام مائي. تم تحليل العينات على مطياف الكتلة Orbitrap Fusion باستخدام Easy NanoLC (Thermo) في الخط ثلاثي التقنية. تم تشغيل العينات على تدرج متزايد من 6 إلى 25٪ ACN + 0.125٪ FA لمدة 70 دقيقة ، ثم 100٪ ACN + 0.125٪ FA لمدة 10 دقائق. تم تحميل مليغرام واحد من كل عينة على عمود شعري زجاجي مسحب ومعبأ داخل المنزل تم تسخينه إلى 60 درجة مئوية. يبلغ طول العمود 30 سم وقطره الخارجي 360 ملم وقطره الداخلي 100 ملم. تمت تعبئة الطرف براتنج C4 بقطر من 5 مم إلى 0.5 سم ، ثم براتنج C18 بقطر 3 مم و 0.5 سم إضافي. تم تعبئة ما تبقى من العمود حتى 30 سم براتنج C18 بقطر 1.8 مم. تم تحقيق التأين بالرش الكهربائي عن طريق تطبيق 2000 فولت على عينة توصيل تقاطع T ، والنفايات ، ونهاية العمود الشعري. تم تشغيل مطياف الكتلة في وضع القطبية الإيجابية. تم إجراء عمليات مسح MS1 في Orbitrap ، مع نطاق مسح يبلغ 375 م / ض إلى 1500 م/ض بدقة 120.000. تم ضبط التحكم التلقائي في الكسب (AGC) على 5 × 10 5 ، مع أقصى وقت لحقن الأيونات يبلغ 100 مللي ثانية. تم إجراء الاستبعاد الديناميكي لمدة 30 ثانية. قمة ن تم استخدامه لعزل الأيونات الشظية ، مع ن = 10. تم استخدام خيار شجرة القرار لتحليل أيون الشظايا. تم عزل الأيونات ذات الحالة الشحنة 2 بين 375 م / ض و 1500 م/ض، وتم عزل الأيونات ذات حالات الشحن من 3 إلى 6 بين 600 م / ض و 1500 م/ض. تم تجزئة أيونات السلائف باستخدام التفكك الناجم عن الاصطدام الثابت. حدث الكشف عن شظية الأيونات في مصيدة الأيونات الخطية ، وتم جمع البيانات في وضع الملف الشخصي. تم تعيين الهدف AGC على 1 × 10 4.

Technical triplicate spectral data were searched against a customized reference proteome comprising the reference proteome of the respective strain (see above) appended to the UPS2 fasta sequences (Sigma) using Proteome Discoverer 2.1 (Thermo). Spectral matching and in silico decoy database construction was performed using the SEQUEST algorithm (39). Precursor ion mass tolerance was set to 50 parts per million. Fragment ion mass tolerance was set to 0.6 Da. Trypsin was specified as the digesting enzyme, and two missed cleavages were allowed. Peptide length tolerated was set to 6 to 144 amino acids. Dynamic modification included oxidation of methionine (+15.995 Da), and static modification included carbamidomethylation of cysteine residues (+57.021 Da). A false-discovery rate of 1% was applied during spectral searches.

Protein Abundance Estimation.

In order to estimate absolute protein abundance, the top3 metric was calculated for each protein as the average of the three highest peptide areas (11, 12). Robust linear regression (as implemented in the Modern Applied Statistics with S (MASS) package ref. 40) was used to calibrate top3 with the UPS2 standard according to the following model to obtain the amount of loaded protein A: l o g 10 A = a + b l o g 10 t o p 3 .

In order to obtain abundance relative to cell dry weight (C), we use a constant ratio γ = 13.94 µmol⋅gDW −1 (41), C i = γ A i ∑ j A j .

Calculation of كapp,max.

For each biological replicate, apparent catalytic rates كتطبيق were calculated as the ratio of protein abundance and measured flux if 1) the protein abundance surpassed 50 pmol⋅gDW −1 and 2) the estimated flux was at least 4 times larger than the range of the 95% CI and larger than 100 fmol⋅gDW −1 h −1 , and the 95% CI did not include zero, as defined in McCloskey et al. (28).

For each of the two biological replicates per strain, كapp,max was calculated as the maximum كapp,max across the 21 strains. Finally, the average كapp,max over the two replicates was calculated and used in the presented analyses.

Parametric Bootstrap for كapp,max.

We used a parametric bootstrap approach to estimate how experimental variability in proteomics and fluxomics data affects كapp,max. For each enzyme, we assumed protein abundance to be normally distributed with mean and SD estimated from the biological replicates for the respective enzyme. In cases where only one biological replicate was available due to lack of detection in the MS/MS, we imputed the missing SD with a linear regression of SD (on log scale) against mean abundance (on log scale) for all available enzymes. Variability in flux data for the respective reaction was also assumed to take a normal distribution, where we used the SD estimated in the MFA procedure that resulted from multiple MFA model reruns on biological triplicates (as described in refs. 6 ⇓ ⇓ –9). For each reaction, 500 bootstrap samples were simulated based on the parameterized normal distributions of protein abundance and flux for that reaction, and these samples were used to calculate 95% CIs for كapp,max.

Machine Learning.

Turnover numbers were extrapolated to the genome scale using the machine learning approach published previously (15). In this supervised machine learning procedure, enzyme features on enzyme network context, enzyme structure, biochemical mechanism, and, in the case of كقط in vitro, assay conditions were utilized (15). These enzyme features were labeled with the كapp,max values estimated in this study, and an ensemble model of elastic net, random forest, and neural network was trained using the caret package (42) and h2o (43). The ensemble used an average of the predictions of the three individual models. Model hyperparameters were chosen in five-times repeated cross-validation (one repetition in the case of neural networks) based on the RMSE metric, as reported in Heckmann et al. (15). For the neural networks, random discrete search was used for optimization of hyperparameters (15).

MOMENT Modeling.

Validation of different turnover number vectors in the MOMENT model was conducted as described in Heckmann et al. (15). In the MOMENT algorithm, a flux distribution is computed that maximizes strain growth rate subject to constraints on the total protein budget of the cell (16). In order to constrain fluxes based on enzyme usage, the algorithm requires كقط parameters (16). Here, we use the respective vectors of كقط from different sources to parameterize MOMENT and thus to predict protein abundances that were experimentally determined by Schmidt et al. (22). The genome-scale metabolic model أناML1515 (44) was used in the R (45) packages sybil (46) and sybilccFBA (47) to construct linear programming problems that were solved in IBM CPLEX version 12.7.

ME Modeling.

To complement the MOMENT-based validation of the computed turnover numbers, a similar validation approach was employed with the أناJL1678b-ME genome-scale model of بكتريا قولونية metabolism and gene expression (48). The ME model contains a detailed description of the cell’s gene expression machinery that is not contained in the MOMENT model. ال كتطبيقs were mapped to أناJL1678b-ME as previously described (15). However, the ME model كتطبيقs were adjusted due to a key difference that lies in the way that the MOMENT and ME model resource allocation models apply enzyme constraints. MOMENT accounts for each unique protein contained within a catalytic enzyme, whereas the ME model formulation accounts for the complete number of protein subunits in an enzyme. As a result, the macromolecular “cost” of catalyzing a reaction in the ME model is often notably higher than in MOMENT. To account for this, the كتطبيقs in the ME model were adjusted by scaling each كتطبيق by the number of protein subunits divided by the number of unique proteins.

The ME model was solved in quad precision using the qMINOS solver (49) and a bisection algorithm (50) to determine the maximum feasible model growth rate, within a tolerance of of 10 −12 . All proteins in a solution with a computed synthesis greater than zero copies per cell were compared to experimentally measured protein abundances. Since the ME model accounts for the activity of many proteins outside of the scope of the كتطبيق prediction method, only those that overlap with predicted كتطبيقs were considered.


ملخص

Adaptations to fluctuating carbon source availability are of particular importance for bacteria. To understand these adaptations, it needs to be understood how a system's behavior emerges from the interactions between the characterized molecules ( Kitano, 2002b ). To attain such a system understanding of bacterial metabolic adaptations to carbon source availability, the coupling between the recognition and adjustment aspects and between the enzymatic and genetic regulatory layers must be understood. For many carbon sources, neither transmembrane sensors nor regulatory proteins with sensing function have been identified. Also, it remains unclear how multiple local regulations work together to accomplish a coherent adjustment on the systems level. In this paper, we show that (1) the interplay of the known interactions in بكتريا قولونية's central metabolism is capable of recognizing carbon sources indirectly, and that (2) these molecular interactions can adjust بكتريا قولونية's metabolic operation between growth on glycolytic and gluconeogenic carbon sources, and that (3) this adaptation is governed by general principles.

We hypothesized that the system-level adaptations between growth on glycolytic and gluconeogenic carbon sources are accomplished by a system-wide regulation architecture that emerges when the known enzymatic and transcriptional regulations become coupled through five transcription factor (TF)–metabolite interactions. To (1) assess whether such coupled molecular interactions can indeed work together to adapt metabolic operation, and if yes, (2) to understand this system-level adaptation in molecular-level detail, we constructed a large-scale differential equation model. The model topology comprises the Embden–Meyerhoff pathway, the tricarboxylic acid (TCA) cycle, the glyoxylate (GLX) shunt, the anaplerotic reactions, the diversion of carbon flux to the GLX shunt, the uptake of glucose, the uptake and excretion of acetate, enzymatic regulation, transcriptional regulation by four TFs, and the regulation of these TFs’ activities through TF–metabolite interactions. We translated the topology into differential equations by assigning the most appropriate rate law to each interaction. The kinetic model comprises 47 ordinary differential equations and 193 parameters. Parameter values were estimated through application of the ‘divide-and-conquer approach’ ( Kotte and Heinemann, 2009 ) on published experimental steady state-omics data sets.

Model simulations reproduce بكتريا قولونية's known physiological behavior in an environment with fluctuating carbon source availability. But how does the في السيليكو cell recognize acetate without a transmembrane sensor for extracellular acetate or a TF binding to intracellular acetate? Similarly, it is unclear whether the glucose sensing function of the phosphotransferase system is the exclusive mechanism to recognize glucose, or whether this sensing function is integrated into a larger sensing architecture. The model suggests that the recognition is performed indirectly through a mechanism we termed distributed sensing of intracellular metabolic fluxes. This mechanism uses two distinct motifs, which we termed pathway usage و flux direction, to establish defined correlations between metabolic fluxes and the levels of certain, here termed flux-signaling metabolites. The binding of these metabolites to TFs propagates the flux information to the transcriptional regulatory layer. A molecular sensor for intracellular metabolic flux is thus defined as a system of regulations and enzyme kinetics, comprising (1) either of the two motifs pathway usage أو flux direction and (2) the binding of the thus established flux-signaling metabolites to TF(s).

مثل في السيليكو cell establishes and uses sensors for several intracellular metabolic fluxes, the overall sensing architecture infers the present carbon sources from a pattern of metabolic fluxes and is as such of a distributed nature. The core of this sensing architecture is formed not by transmembrane sensors but by four flux sensors, which establish flux-signaling metabolites according to the two proposed general motifs. These flux sensors use intracellular metabolic flux as a means to correlate the presence of extracellular carbon sources with the levels of intracellular metabolites. The recognition of glucose through the PTS transmembrane complex is embedded as one flux sensor in this distributed sensing architecture the other three flux sensors function without the help of transmembrane complexes.

ال في السيليكو cell achieves the coupling between recognition and adjustment through its TFs, whose activities respond to the available carbon sources and at the same time regulate the expression of target genes. This combined recognition and adjustment, centered on the four TFs, closes four global feedback loops that overarch the metabolic and genetic layers as illustrated in Figure 6. The adaptation of the في السيليكو cell arises from the global feedback loop-embedded, flux sensor-adjusted transcriptional regulation of the four TFs, with each TF performing one part of the overall adaptation. This adaptation incorporates both the influence of the metabolic on the genetic layer, achieved through TF–metabolite interactions, and of the genetic on the metabolic layer, achieved through the impact of adjusted enzyme levels on metabolic fluxes.

The existence of the global feedback architectures challenges the conventional view that top-level regulatory proteins recognize environmental conditions and adjust downstream metabolic operation. It suggests that the capability for closed-loop self-regulation can emerge within metabolism itself and therefore, metabolic operation may adapt itself autonomously (not requiring upstream sensing and regulation) to changing carbon sources.

To conclude, the presented differential equation model of بكتريا قولونية's central metabolism offers a consistent explanation of how a multitude of known molecular interactions fit into a coherent systems picture the interactions work together like gear wheels that mesh with one another to adapt central metabolism between growth on the glycolytic substrate glucose and the gluconeogenic substrate acetate. The deduced general functional principles provide the missing link to understand system-level adaptations to carbon sources in molecular-level detail. The proposed principles fall under the umbrella of distributed flux sensing. The flux sensing mechanism entails the binding of TFs to flux-signaling metabolites, which are established through the motifs signaling of pathway usage و signaling of flux direction, and are embedded in global feedback loop architectures. These principles allow an autonomous adaptation of metabolic operation to growth in fluctuating environments.


الحواشي

Electronic supplementary material is available online at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5134778.

Published by the Royal Society under the terms of the Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, which permits unrestricted use, provided the original author and source are credited.

مراجع

Cornish-Bowden A, Cárdenas ML, Division NATOSA

1990 Control of metabolic processes . NATO ASI series Series A, Life sciences . New York, NY : Plenum Press . Crossref, Google Scholar

وآخرون. 2016 Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux . علم 354, aaf2786. (doi:10.1126/science.aaf2786) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

وآخرون. 2017 Genome-scale architecture of small molecule regulatory networks and the fundamental trade-off between regulation and enzymatic activity . تقارير الخلية 20, 2666-2677. كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2018 New concepts in feedback regulation of glucose metabolism . بالعملة. رأي. Syst. بيول. 8, 32-38. (‘Regulatory and metabolic networks’ Special Section: Single cell and noise). كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Tanner LB, Goglia AG, Wei MH, Sehgal T, Parsons LR, Park JO, White E, Toettcher JE, Rabinowitz JD

. 2018 Four key steps control glycolytic flux in mammalian cells . Cell Syst. 7, 49-62. (doi:10.1016/j.cels.2018.06.003) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1968 The energy charge of the adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction with feedback modifiers . الكيمياء الحيوية 7, 4030-4034. (doi:10.1021/bi00851a033) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1969 Limitation of metabolite concentrations and the conservation of solvent capacity in the living cell. في Current topics in cellular regulation (eds BL Horecker, ER Stadtman), vol. 1, pp. 29–43. New York, NY: Academic Press. منحة جوجل

Jeske L, Placzek S, Schomburg I, Chang A, Schomburg D

. 2018 BRENDA in 2019: a European ELIXIR core data resource . الدقة الأحماض النووية. 47, D542-D549. (doi:10.1093/nar/gky1048) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1991 Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of الإشريكية القولونية . جيه مول. بيول. 222, 599-620. (doi:10.1016/0022-2836(91)90499-V) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zhou HX, Rivas GN, Minton AP

. 2008 Macromolecular crowding and confinement: biochemical, biophysical, and potential physiological consequences . Annu. القس بيوفيس. 37, 375-397. (doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125817) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Parry BR, Surovtsev IV, Cabeen MT, O’Hern CS, Dufresne ER, Jacobs-Wagner C

. 2014 The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity . زنزانة 156, 183-94. (doi:10.1016/j.cell.2013.11.028) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1995 The control of flux . بيوتشيم. شركة عبر. 23, 341-366. (doi:10.1042/bst0230341) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kreuzer-Martin HW, Lott MJ, Ehleringer JR, Hegg EL

. 2006 Metabolic processes account for the majority of the intracellular water in log-phase الإشريكية القولونية cells as revealed by hydrogen isotopes . الكيمياء الحيوية 45, 13622-30. (doi:10.1021/bi0609164) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Systems biology: an introduction to metabolic control analysis . Seattle, WA : Ambrosius Publishing . منحة جوجل

Hofmeyr J-HS, Cornish-Bowden A

. 2000 Regulating the cellular economy of supply and demand . FEBS Lett. 476, 47-51. (doi:10.1016/S0014-5793(00)01668-9) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1994 Economics and thermodynamics , 1st edn. Amsterdam, The Netherlands : Springer . Crossref, Google Scholar

وآخرون. 2008 Lehninger principles of biochemistry , 5th edn. New York, NY : W.H. Freeman . منحة جوجل

. 1973 Regulation in metabolism . London, UK : John Wiley & Sons . منحة جوجل

. 2003 Information theory explanation of the fluctuation theorem, maximum entropy production and self-organized criticality in non-equilibrium stationary states . J. Phys. a-Math. Gen. 36, 631-641. (doi:10.1088/0305-4470/36/3/303) Crossref, Google Scholar

Presse S, Ghosh K, Lee J, Dill KA

. 2013 Principles of maximum entropy and maximum caliber in statistical physics . Rev. Mod. Phys. 85, 1115-1141. (doi:10.1103/RevModPhys.85.1115) Crossref, ISI, Google Scholar

Cannon WR, Zucker JD, Baxter DJ, Kumar N, Baker SE, Hurley JM, Dunlap JC

. 2018 Prediction of metabolite concentrations, rate constants and post-translational regulation using maximum entropy-based simulations with application to central metabolism of Neurospora crassa . Processes 6, 63. (doi:10.3390/pr6060063) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1910 The mechanics of irreversible phenomenon . C. R. Hebdomadaires Des Seances De L Acad. Des Sci. 151, 1052-1055. منحة جوجل

. 1983 The development of transition-state theory . J. Phys. تشيم. 87, 2657-2664. (doi:10.1021/j100238a002) Crossref, ISI, Google Scholar

Bennett BD, Kimball EH, Gao M, Osterhout R, Van Dien SJ, Rabinowitz JD

. 2009 Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in الإشريكية القولونية . نات. تشيم. بيول. 5, 593-9. (doi:10.1038/nchembio.186) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Park JO, Rubin SA, Xu YF, Amador-Noguez D, Fan J, Shlomi T, Rabinowitz JD

. 2016 Metabolite concentrations, fluxes and free energies imply efficient enzyme usage . نات. تشيم. بيول. 12, 482-9. (doi:10.1038/nchembio.2077) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1957 A Markovian decision process . J. الرياضيات. ميكانيكي. 6, 679-684. (doi:10.1512/iumj.1957.6.56038) Google Scholar

. 1998 Reinforcement learning: an introduction . Cambridge, MA : MIT Press . منحة جوجل

. 1989 Learning from delayed rewards. PhD thesis. جامعة كامبريدج. Cambridge, UK. منحة جوجل

. 1988 Learning to predict by the methods of temporal differences . Mach. يتعلم. 3, 9-44. (doi:10.1007/BF00115009) Crossref, Google Scholar

. 1996 Generalization in reinforcement learning: successful examples using sparse coarse coding. في Advances in neural information processing systems (eds DS Touretzky, MC Mozer, ME Hasselmo), vol. 8, pp. 1038–1044. كامبريدج ، ماساتشوستس: مطبعة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. منحة جوجل

. 1994 On-line Q-learning using connectionist systems، المجلد. 37. University of Cambridge, Department of Engineering Cambridge, UK. See http://mi.eng.cam.ac.uk/reports/svr-ftp/auto-pdf/rummery_tr166.pdf. منحة جوجل

. 1992 Q-learning . Mach. يتعلم. 8, 279-292. (doi:10.1007/BF00992698) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2016 Nonequilibrium thermodynamic formalism of nonlinear chemical reaction systems with Waage–Guldberg's law of mass action . تشيم. Phys. 472, 241-248. (doi:10.1016/j.chemphys.2016.03.026) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2010 Physical origins of entropy production, free energy dissipation, and their mathematical representations . Phys. Rev. E 81, 051133. (doi:10.1103/PhysRevE.81.051133) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2014 Simulating metabolism with statistical thermodynamics . بلوس واحد 9, e103582. (doi:10.1371/journal.pone.0103582) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1998 Solvation, reorganization energy, and biological catalysis . J. بيول. تشيم. 273, 26 257-26 260. (doi:10.1074/jbc.273.41.26257) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1967 The labeling of pentose phosphate from glucose- 14 C and estimation of the rates of transaldolase, transketolase, the contribution of the pentose cycle, and ribose phosphate synthesis . الكيمياء الحيوية 6, 2227-2247. (doi:10.1021/bi00859a046) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

وآخرون. 2018 Circadian proteomic analysis uncovers mechanisms of post-transcriptional regulation in metabolic pathways . أنظمة الخلايا 7, 613-626. (doi:10.1016/j.cels.2018.10.014) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Heimlicher MB, Bächler M, Liu M, Ibeneche-Nnewihe C, Florin EL, Hoenger A, Brunner D

. 2019 Reversible solidification of fission yeast cytoplasm after prolonged nutrient starvation . J. خلية علوم. 132, jcs231688. (doi:10.1242/jcs.231688) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Saha A, Connelly S, Jiang J, Zhuang S, Amador DT, Phan T, Pilz RB, Boss GR

. 2014 Akt phosphorylation and regulation of transketolase is a nodal point for amino acid control of purine synthesis . مول. زنزانة 55, 264-76. (doi:10.1016/j.molcel.2014.05.028) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2008 Allosteric regulatory enzymes . Berlin, Germany : Springer Science & Business Media . Crossref, Google Scholar

. 1977 Cellular energy metabolism and its regulation . نيويورك ، نيويورك: مطبعة أكاديمية. منحة جوجل

Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM

. 2005 Lehninger principles of biochemistry ، الطبعة الرابعة. New York, NY : W.H. Freeman . منحة جوجل

Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Stryer L

. 2007 الكيمياء الحيوية , 5th edn. New York, NY : W.H. Freeman . منحة جوجل

Oakhill JS, Steel R, Chen ZP, Scott JW, Ling N, Tam S, Kemp BE

. 2011 AMPK is a direct adenylate charge-regulated protein kinase . علم 332, 1433-1435. (doi:10.1126/science.1200094) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chapman AG, Fall L, Atkinson DE

. 1971 Adenylate energy charge in الإشريكية القولونية during growth and starvation . J. باكتيريول. 108, 1072-1086. (doi:10.1128/JB.108.3.1072-1086.1971) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1974 The survival of Peptococcus prevotii in relation to the adenylate energy charge . علم الاحياء المجهري 80, 291-299. (doi:10.1099/00221287-80-1-291) ISI, Google Scholar

Aithal HN, Walsh-Reitz MM, Toback FG

. 1985 Regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by a cytosolic protein . أكون. J. Physiol. 249, C111-C116. (doi:10.1152/ajpcell.1985.249.1.C111) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1967 Kinetic studies on the reaction catalyzed by phosphoglycerate kinase. II. The kinetic relationships between 3-phosphoglycerate, MgATP 2− activating metal ion . بيوكيم. بيوفيز. Acta 132, 33-40. (doi:10.1016/0005-2744(67)90189-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1974 The control of pyruvate kinases of الإشريكية القولونية. I. Physicochemical and regulatory properties of the enzyme activated by fructose 1,6-diphosphate . J. بيول. تشيم. 249, 265-274. PubMed و ISI و Google Scholar

Waygood EB, Rayman MK, Sanwal BD

. 1975 The control of pyruvate kinases of الإشريكية القولونية. II. Effectors and regulatory properties of the enzyme activated by ribose 5-phosphate . علبة. J. Biochem. 53, 444-54. (doi:10.1139/o75-061) Crossref, PubMed, Google Scholar

Waygood EB, Mort JS, Sanwal BD

. 1976 The control of pyruvate kinase of الإشريكية القولونية. Binding of substrate and allosteric effectors to the enzyme activated by fructose 1,6-bisphosphate . الكيمياء الحيوية 15, 277-82. (doi:10.1021/bi00647a006) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2003 Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation . بيوتشيم. شركة عبر. 31, 1143-1151. (doi:10.1042/bst0311143) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

وآخرون. 2014 Regulation of G6PD acetylation by SIRT2 and KAT9 modulates NADPH homeostasis and cell survival during oxidative stress . EMBO J. 33, 1304-1320. (doi:10.1002/embj.201387224) PubMed, ISI, Google Scholar

. 1999 Structure, function and regulation of pyruvate carboxylase . بيوتشيم. ج. 340 (Pt 1), 1-16. (doi:10.1042/bj3400001) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Regulation of glycolytic enzyme phosphoglycerate mutase-1 by Sirt1 protein-mediated deacetylation . J. بيول. تشيم. 287, 3850-3858. (doi:10.1074/jbc.M111.317404) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 Environmental statistics and optimal regulation . PLoS Comput. بيول. 10, e1003826. (doi:10.1371/journal.pcbi.1003826) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1922 Contribution to the energetics of evolution . بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 8, 147-151. (doi:10.1073/pnas.8.6.147) Crossref, PubMed, Google Scholar

Niebel B, Leupold S, Heinemann M

. 2019 An upper limit on Gibbs energy dissipation governs cellular metabolism . نات. Metab. 1, 125-132. (doi:10.1038/s42255-018-0006-7) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1944 A method for the solution of certain non-linear problems in least squares . Quart. تطبيق رياضيات. 2, 164-168. (doi:10.1090/qam/10666) Crossref, Google Scholar

. 1963 An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters . J. Soc. Ind. Appl. رياضيات. 11, 431-441. (doi:10.1137/0111030) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1985 Metabolic control and its analysis. additional relationships between elasticities and control coefficients . يورو. J. Biochem. 148, 555-561. (doi:10.1111/j.1432-1033.1985.tb08876.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

Sauro HM, Small JR, Fell DA

. 1987 Metabolic control and its analysis. Extensions to the theory and matrix method . يورو. J. Biochem. 165, 215-221. (doi:10.1111/j.1432-1033.1987.tb11214.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Chemical biophysics: quantitative analysis of cellular systems . Cambridge texts in biomedical engineering . كامبريدج ، المملكة المتحدة: مطبعة جامعة كامبريدج. Crossref, Google Scholar

. 1955 Time’s speed regulator: the optimum efficiency for maximum power output in physical and biological systems . أكون. علوم. 43, 331-343. ISI ، الباحث العلمي من Google

Paszke A, Gross S, Chintala S, Chanan G, Yang E, DeVito Z, Lin Z, Desmaison A, Antiga L, Lerer A

. 2017 Automatic differentiation in PyTorch . في 31st Conf. on Neural Information Processing Systems (NIPS 2017), Long Beach, CA, 9 December . See https://openreview.net/forum?id=BJJsrmfCZ. منحة جوجل

Flamholz A, Noor E, Bar-Even A, Milo R

. 2012 eQuilibrator—the biochemical thermodynamics calculator . الدقة الأحماض النووية. 40, D770-D775. (doi:10.1093/nar/gkr874) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Goldberg RN, Tewari YB, Bhat TN

. 2004 Thermodynamics of enzyme-catalyzed reactions—a database for quantitative biochemistry . المعلوماتية الحيوية 20, 2874-5877. (doi:10.1093/bioinformatics/bth314) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Noor E, Haraldsdottir HS, Milo R, Fleming RM

. 2013 Consistent estimation of gibbs energy using component contributions . PLoS Comput. بيول. 9, e1003098. (doi:10.1371/journal.pcbi.1003098) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Jinich A, Rappoport D, Dunn I, Sanchez-Lengeling B, Olivares-Amaya R, Noor E, Even AB, Aspuru-Guzik A

. 2014 Quantum chemical approach to estimating the thermodynamics of metabolic reactions . علوم. اعادة عد. 4, 7022. (doi:10.1038/srep07022) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar


مناقشة

Estimation of enzyme reaction rates

As shown in Table 1, the accuracy of the estimations of the enzyme reaction rates was confirmed by the reproduced metabolite concentrations, except for PGP in بكتريا قولونية. Since the concentration of PGP was very low (average concentration, 3.60 × 10 -3 mM), even a slight error in the enzyme reaction rate had a large influence. In fact, the average errors between the true enzyme reaction rate time series and the estimated enzyme reaction rate time series for both GAPDH (PGP-producing enzyme) and PGK (PGP-consuming enzyme) in بكتريا قولونية were adequately small, 2.44% and 1.46%, respectively. In the process for distinguishing dynamic/static enzymes, the average of the squared errors of all metabolite concentrations is used to calculate the fitness function (Eq. (5)) thus, an error in only one metabolite concentration has a limited effect. Actually, the results of distinguishing dynamic/static enzymes without the PGP time series (data not shown) were entirely the same as those shown in Table 2. However, if many metabolites with low concentrations are included in the modelled metabolic system, the processes for distinguishing dynamic/static enzymes may cause an erroneous conclusion to be drawn. This is a limitation of the current procedure. In comparison with the results for بكتريا قولونية, errors for all metabolites for S. cerevisiae were adequately small, because the dynamics of the metabolic system in S. cerevisiae is relatively slow compared with the sampling frequency.

Another difficulty in applying the proposed method is that we assume that the concentrations of all metabolites are measurable. It is expected that high-throughput measurement techniques for detecting a huge number of metabolites, such as capillary electrophoresis combined with mass spectrometry (CE-MS) [17–19], can be used for such comprehensive measurements. The 1-s sampling interval employed in this study is feasible, because some rapid-sampling instruments capable of drawing multiple samples within 1 s from a bioreactor have already been developed [26–28].

Distinction of dynamic and static enzymes

After a process for distinguishing dynamic/static enzymes is completed, the MRE in the corresponding hybrid model can be estimated using the linear relationship between the MRE in the process for distinguishing dynamic/static enzymes and the MRE in the hybrid model (Figure 3). This information helps to build a hybrid model that has the desired accuracy.

The staircase pattern of the relationships between the error and static enzyme ratio with decreasing ث, observed in Figure 4, was probably caused by a property of metabolic systems. In a testing system, the number of enzymes that can potentially be allocated to the static module may be restricted. لو ث is greatly changed, the few potentially static enzymes would eventually start to be converted to static enzymes.

Weighting coefficient in the fitness function

The weighting coefficient in the fitness function (Eq. (5)) is a tuning parameter. Since a suitable value for the weighting coefficient (ث) is not given بداهة, we need to consider how to define the value.

As shown in Figure 4, with a ث of 1.000, about half of the enzymes were discriminated to the static module. Thus, a large amount of experimental work can be saved because no kinetic information is required by the static module. The MRE at ث = 1.000 was 15.2% for the بكتريا قولونية hybrid model and 18.6% for the S. cerevisiae hybrid model (Figure 4). These errors are acceptable considering the accuracy of the experimentally measured metabolite concentrations. هكذا، ث = 1.000 may simply be chosen at the initial trial stage of model construction. When a more precise model is required, a smaller ث can be used. حتى لو ث is set to between 0.025 and 0.100, the proportion of static enzymes remains at about 30% for both the metabolic systems tested. Our recommendation for ث for general modelling is 0.050. At around this ث value, the sensitivity of the error to a change of ث is low thus, strict specification of ث غير مطلوب. Moreover, even if the actual error in the constructed hybrid model becomes considerably higher than the expected value as in the case of S. cerevisiae في ث = 0.250 the actual error remains low.

Noise in metabolome data

As shown in Table 2, almost the same results in distinguishing dynamic/static enzymes were obtained between the procedures using noise-free data and those using noise-added data. This result could be predicted because most metabolite time series were successfully reproduced from the noisy data by the smoothing treatment, as shown in Figure S3. This result indicates that the proposed method for distinguishing dynamic/static enzymes can be applied to noisy measurements if a suitable noise reduction method is employed. To remove noise and obtain the slopes of metabolite concentration time series, a smoothing technique based on an artificial neural network, proposed by Voit وآخرون. [29–31], is efficient. Many other noise cancellation techniques have been proposed for biochemical time series data [32–35]. For example, Rizzi وآخرون. [36] obtained time-course functions of metabolites from noisy metabolite concentration measurements and used those functions to tune the parameters in their dynamic model.

Toward construction of accurate hybrid models

In the HDS method, accurate kinetics should be known not only for system boundary enzymes but also for all enzymes assigned to the dynamic modules. For this reason, high-throughput techniques for determining accurate and detailed enzyme kinetics are needed for the efficient development of models of metabolic systems. A promising power-law approach, generalized mass action (GMA) [37, 38], may be used to solve this problem. This method has a large representational space that enables enzyme kinetics to be sufficiently expressed in spite of its simple fixed form. Although modelling that uses this kind of power-law approach from time series data is often difficult owing to their nonlinear properties, Polisetty وآخرون. [39] have proposed a method employing branch-and-bound principles to find optimized parameters in GMA models. Using this method, the global optimal parameter set can be efficiently searched.


شاهد الفيديو: الأحياء إثرائي - صف 10 - طريقة عمل الانزيم (أغسطس 2022).