معلومة

D5. تطابقات متعددة من نفس التسلسل - علم الأحياء


1. سيكون هذا صحيحًا بشكل خاص إذا كان هناك هيكلان محتملان يكونان قريبين بدرجة كافية من الطاقة الحرة ولكن مفصولة بحاجز طاقة تنشيط كبير ، مما يحول دون إعادة الترتيب التوافقي البسيط لتشكل إلى آخر.

2. البروتينات المتحولة: بالإضافة إلى بروتينات البريون ، يبدو أن العديد من البروتينات يمكن أن تتبنى أكثر من شكل واحد تحت نفس مجموعة الشروط. على عكس بروتينات البريون ، حيث يكون تكوين متغير بنية بيتا أمرًا لا رجوع فيه نظرًا لأن التغيير التوافقي مرتبط بالتجميع ، يمكن للعديد من البروتينات تغيير التطابق بشكل عكسي. في كثير من الأحيان ، لا يبدو أن هذه التغييرات مرتبطة فقط بتفاعلات الربط التي تؤدي إلى التغيير. وصف مورزين البروتينات التي تغير التوافق عند تغير الأس الهيدروجيني (البروتينات السكرية الفيروسية) ، وحالة الأكسدة والاختزال (قناة الكلوريد) ، وأزمرة ثاني كبريتيد (الليزوزيم) ، والليغند المرتبط (بوليميريز الحمض النووي الريبي عند بدء ثم إطالة بوليمر الحمض النووي الريبي المتنامي). يستشهد ببروتينين يبدو أنهما يغيران حالتهما بدون إشارات خارجية. وتشمل هذه المواد Mad2 ، حيث يتشارك المطابقان تشابهًا واسعًا ، و Ltn10 (lymphotactin) ، حيث لا يتشاركان فيهما. يرتبط أحد أشكال اللمفوتكتين (Ltn 10) بمستقبلات ليمفوكين مماثلة ، بينما يرتبط الآخر (Ltn 40) بالهيبارين. قد تلعب حركيات الطي دورًا في هذه الأمثلة أيضًا ، حيث إن البروتينات القادرة على الطي إلى اثنين من المطابقات بشكل مستقل وبسرعة قد تمنع حدوث اختلال وتجميع قد يحدث إذا كان عليها أن تتكشف تمامًا أولاً قبل الانتقال التوافقي. يغير كل من Mad2 و Ltn10 التشكل من خلال تشكيلات عابرة من الثنائيات ، والتي تسهل التغييرات التوافقية دون الكشف على نطاق واسع. يمكن أن تؤدي الطفرات في Ltn10 إلى تبني البروتين للتشكيل Ltn40 ، وبالتالي يمكن للبروتينات "المتحولة" البدائية ، عن طريق الطفرة البسيطة ، إنتاج وظائف بروتينية جديدة.

3. البروتينات المضطربة جوهريًا (IDPs): تم العثور على العديد من الأمثلة على البروتينات المختلة جزئيًا أو كليًا ولكنها لا تزال تحتفظ بوظائفها البيولوجية. للوهلة الأولى ، قد يبدو هذا غير متوقع ، فكيف يمكن لمثل هذا البروتين أن يربط ليجنده الطبيعي بالخصوصية والانتقائية للتعبير عن وظيفته؟ بالطبع يمكن للمرء أن يفترض أن ارتباط الترابط سيؤدي إلى تغييرات توافقية ضرورية للوظيفة (مثل الحفز) في مثال متطرف للملاءمة المستحثة للرابط مقارنة بتناسب "القفل والمفتاح". منذ عقود ، تنبأ لينوس بولينج بأن الأجسام المضادة ، وهي البروتينات التي تتعرف على الجزيئات الأجنبية (المستضدات) ، سترتبط بشكل غير محكم بالمستضد ، يليه تغيير في التركيب لتشكيل توافق أكثر تكاملاً وأكثر إحكامًا. كانت هذه أسهل طريقة للسماح لعدد محدود من الأجسام المضادة البروتينية المحتملة بربط عدد لا نهائي على ما يبدو من الجزيئات الأجنبية المحتملة. هذه بالفعل إحدى الطرق التي يمكن للأجسام المضادة من خلالها التعرف على المستضدات الأجنبية. الأجسام المضادة التي ترتبط بالمستضد ذي الألفة العالية وبالتالي الخصوصية العالية من المرجح أن ترتبط من خلال القفل وتناسب المفتاح. (ومع ذلك ، لم يكن بولينج يعلم أن الجينات التي تشفر سلاسل البروتينات في الأجسام المضادة يتم تقطيعها بشكل مختلف وتخضع لمعدلات طفرة محسّنة تسمح بتوليد تنوع لا يُصدق من الأجسام المضادة من مجموعة محدودة من الجينات).

تشير التقديرات إلى أن أكثر من نصف البروتينات الأصلية بها مناطق مضطربة (أكثر من 30 حمضًا أمينيًا) ، وأكثر من 20٪ من البروتينات مضطربة تمامًا. يتم إثراء مناطق الاضطراب في السلاسل الجانبية القطبية والمشحونة التي تلي ذلك لأن هذه قد تتوقع أن تفترض العديد من المطابقات المتاحة في المحاليل المائية مقارنة بالتسلسلات المخصبة في السلاسل الجانبية الكارهة للماء ، والتي من المحتمل أن تنهار إلى قلب مضغوط مستقر بتأثير كاره للماء. تميل الطفرات في المناطق المضطربة إلى الحفاظ على المنطقة المضطربة ، مما يشير إلى أن المنطقة المضطربة مفيدة للوظيفة "المستقبلية". بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطفرات التي تسبب تسلسلًا غير مشفر ينتج عنه ترميز واحد ينتج دائمًا تسلسلات بروتينية مضطربة. تميل البروتينات المضطربة إلى امتلاك خصائص تنظيمية وربط روابط متعددة ، مقارنةً بالبروتينات المطلوبة ، والتي تشارك في الارتباط الترابطي المحدد للغاية الضروري للحفز والنقل. تبين أيضًا أن التركيز داخل الخلايا للبروتينات المضطربة أقل من البروتينات المطلوبة ، ربما لمنع حدوث تفاعلات الارتباط غير المناسبة بوساطة التفاعلات الكارهة للماء ، على سبيل المثال. تشمل العمليات لتحقيق ذلك تحلل mRNA أسرع والبروتين وترجمة أبطأ لـ mRNA للبروتينات المضطربة. لسبب مشابه ، يتم استهداف البروتينات المشوهة للتحلل أيضًا. يوضح الشكل (أ) أدناه متوسط ​​الشحنة الصافية مقابل متوسط ​​الكراهية للماء لـ 275 بروتينًا مطويًا و 91 بروتينًا مكشوفًا محليًا. يوضح الشكل (ب) التركيب النسبي للأحماض الأمينية للبروتينات الكروية (المرتبة) مقارنة بمناطق الاضطراب التي تزيد عن 10 أحماض أمينية في البروتينات المضطربة. تم الحصول على الشريطين الرماديين المختلفين بإصدارين مختلفين من البرنامج المستخدم لتحليل البروتينات. مرة أخرى ، يوضح الرسم البياني إثراء الأحماض الأمينية المحبة للماء في البروتينات المضطربة.

الشكل: خصائص البروتينات المضطربة جوهريًا

من مجلة الوصول المفتوح: Dunker، A. et al. BMC Genomics 2008 ، 9 (ملحق 2): S1 دوى: 10.1186 / 1471-2164-9-S2-S1

يمكن استخدام العديد من الطرق التجريبية لاكتشاف المناطق المضطربة في البروتينات. لم يتم حل هذه المناطق جيدًا في الهياكل البلورية للأشعة السينية (لها عوامل ب عالية). ستظهر هياكل حل الرنين المغناطيسي النووي تطابقات متعددة ومختلفة. وبالمثل ، فإن التحليل الطيفي للقرص المضغوط سيُظهر بنية ثانوية غير واضحة المعالم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قياسات حجم المحلول (تشتت الضوء والطرد المركزي) ستظهر توزيعات حجم أكبر لبروتين معين.

ما أنواع البروتينات التي تحتوي على اضطراب؟ تم تطوير الأساليب الحسابية التجريبية والجديدة المذكورة أعلاه لتصنيف البروتينات حسب درجة اضطرابها. يبدو أن هناك عددًا أكبر من النازحين داخليًا في حقيقيات النوى مقارنةً بأرشيا وبدائيات النوى. يشارك العديد من IDPS في عمليات إرسال الإشارات الخلوية (عندما تقوم الجزيئات الخارجية بإشارة الخلايا للاستجابة عن طريق التكاثر ، والتمايز ، والموت ، وما إلى ذلك). يبدو أن معظمهم يقيمون في النواة. ترتبط النسبة الأكبر من الأشخاص النازحين داخليًا ببروتينات أخرى وكذلك بالحمض النووي. تشير هذه النتائج إلى أن IEPs ضرورية لوظيفة البروتين وربما تمنح مزايا كبيرة للخلايا حقيقية النواة حيث يمكن استنباط وظائف متعددة من تفاعل IEP واحد (مشتق من جين واحد) مع شركاء ربط بروتين مختلفين. سيؤدي هذا إلى زيادة حجم الجينوم الفعال في البشر بشكل كبير ، على سبيل المثال ، من حوالي 25000 بوظيفة محددة إلى أكثر من ذلك بكثير. هذا لا يأخذ في الاعتبار حتى الوظائف المتزايدة المستمدة من التعديلات الكيميائية اللاحقة للترجمة.

سنناقش البروتينات المضطربة جوهريًا بشكل أكبر في الفصل 5. ما يتضح من الاكتشاف الأخير هو أن بنية البروتين سائلة ومعقدة وأن مفاهيمنا وكلماتنا البسيطة للإشارة إلى البروتينات على أنها أصلية أو مشوهة مضللة وتقيد أفكارنا حول كيفية إثارة بنية البروتين الوظيفة البيولوجية. على سبيل المثال ، ماذا تعني كلمة "أصلي" ، إذا كانت البروتينات موجودة في حالات متعددة في الجسم الحي وفي المختبر في وقت واحد؟ صاغ Dunker et al (2001) مفهوم "Protein Trinity" لتجاوز فكرة أن بروتينًا واحدًا ينثني إلى حالة واحدة تؤدي إلى وظيفة واحدة. بدلاً من ذلك ، تتعايش كل حالة في "الثالوث" ، المرتبة والمنهارة (أو الكريات المنصهرة) والممتدة (الملف العشوائي) في الخلية. ومن ثم يمكن اعتبار الجميع "أصليين" وكلهم يساهمون في وظيفة الخلية. يمكن أن يرتبط IDP واحد بالعديد من شركاء البروتين المختلفين ، كل منهم ينتج هياكل ووظائف نهائية مختلفة. سيكون النازحون داخليًا أيضًا أكثر سهولة في الوصول وبالتالي عرضة لتحلل البروتين ، مما قد يؤدي إلى آلية بسيطة للتحكم في تركيزاتهم ، وهي طريقة مهمة لتنظيم نشاطهم البيولوجي. وبالمثل ، فإن ميلهم إلى التعديل الكيميائي لما بعد الترجمة سيؤدي إلى أنواع جديدة من التنظيم البيولوجي.

الشكل: ثالوث البروتين: الدول المرتبة والمنهارة والممتدة

هذه الأفكار لها تداعيات عميقة على فهمنا للتعبير عن النمط الظاهري الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، يتوفر عالم جديد تمامًا من أهداف الأدوية من خلال إيجاد الأدوية التي تعدل التحولات بين حالات البروتين المنتظمة والمنهارة والممتدة. وبالمثل ، يمكن فهم الآثار الجانبية للأدوية من خلال التحقيق في آثار الأدوية لهذه التحولات في الأشخاص النازحين داخليًا الذين لم يتم استهدافهم في البداية.

4. التحفيز بواسطة شركة Molten Globule: مثال حديث (Bemporad) على أن أسيل فوسفاتيز البكتيري له نشاط تحفيزي ككرة مصهورة تتساءل عن مفاهيمنا عن البنية ونشاط الإنزيم. في هذا المثال ، لم يؤدي تفاعل الركيزة إلى إحداث تغييرات توافقية عالمية في البروتين. أظهرت محاكاة الديناميكيات الجزيئية وجود العديد من التوافقات المختلة جزئيًا للبروتين ، وأن الاضطراب يشمل الموقع النشط. ومع ذلك ، فإن أجزاء من البروتين تكون أكثر ترتيبًا وتشكل "سقالة" تحافظ على الأحماض الأمينية الرابطة المحفزة والركيزة بالقرب بما يكفي بحيث يمكن أن يؤدي الارتباط إلى إعادة ترتيب مطابقة في الجانب النشط والنشاط التحفيزي اللاحق.


المحاذاة الهيكلية

المحاذاة الهيكلية يحاول إنشاء تجانس بين اثنين أو أكثر من الهياكل البوليمرية بناءً على شكلها وتشكلها ثلاثي الأبعاد. يتم تطبيق هذه العملية عادةً على الهياكل الثلاثية للبروتين ولكن يمكن أيضًا استخدامها لجزيئات الحمض النووي الريبي الكبيرة. على عكس التراكب الهيكلي البسيط ، حيث تُعرف على الأقل بعض المخلفات المكافئة للهيكلين ، فإن المحاذاة الهيكلية لا تتطلب بداهة معرفة المناصب المعادلة. المحاذاة الهيكلية هي أداة قيمة لمقارنة البروتينات ذات التشابه المنخفض في التسلسل ، حيث لا يمكن بسهولة اكتشاف العلاقات التطورية بين البروتينات من خلال تقنيات محاذاة التسلسل القياسي. لذلك يمكن استخدام المحاذاة الهيكلية للإشارة إلى العلاقات التطورية بين البروتينات التي تشترك في تسلسل مشترك ضئيل جدًا. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند استخدام النتائج كدليل على الأصل التطوري المشترك بسبب التأثيرات المربكة المحتملة للتطور المتقارب الذي تتلاقى فيه متواليات الأحماض الأمينية المتعددة غير ذات الصلة على بنية ثلاثية مشتركة.

يمكن للمحاذاة الهيكلية مقارنة تسلسلين أو تسلسلات متعددة. نظرًا لأن هذه المحاذاة تعتمد على معلومات حول جميع المطابقات ثلاثية الأبعاد لتسلسل الاستعلام ، لا يمكن استخدام الطريقة إلا في التسلسلات التي تُعرف فيها هذه الهياكل. عادة ما يتم العثور عليها عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. من الممكن إجراء محاذاة هيكلية على الهياكل التي تنتجها طرق التنبؤ الهيكلية. في الواقع ، غالبًا ما يتطلب تقييم مثل هذه التنبؤات مواءمة بنيوية بين النموذج والهيكل الحقيقي المعروف لتقييم جودة النموذج. [1] المحاذاة الهيكلية مفيدة بشكل خاص في تحليل البيانات من الجينوميات الهيكلية وجهود البروتينات ، ويمكن استخدامها كنقاط مقارنة لتقييم المحاذاة التي تنتجها طرق المعلوماتية الحيوية القائمة على التسلسل البحت. [2] [3] [4]

نواتج المحاذاة الهيكلية هي تراكب لمجموعات الإحداثيات الذرية والحد الأدنى لانحراف الجذر التربيعي (RMSD) بين الهياكل. يشير RMSD لهيكلين متماثلين إلى اختلافهما عن بعضهما البعض. يمكن أن تكون المحاذاة الهيكلية معقدة بسبب وجود مجالات بروتينية متعددة داخل واحد أو أكثر من هياكل الإدخال ، لأن التغييرات في الاتجاه النسبي للمجالات بين هيكلين ليتم محاذاتهما يمكن أن يؤدي إلى تضخيم RMSD بشكل مصطنع.


نتائج ومناقشة

التين & # x200B الشكل 1 1 أ (قمة و وسط) يعرض صورة مجهرية إلكترونية مظللة دوارة لـ (I27-PEVK)3 بولي بروتين. تُظهر الصور المجهرية مجموعات من ثلاثة مجالات كروية يبدو أنها مقيدة بسلسلة غير مرئية. نفسر هذه النتائج كدليل على ثلاث وحدات I27 مميزة بوضوح مفصولة بقطعتين PEVK. يبلغ طول منطقة PEVK 186 aa (www.embl-heidelberg.de & # x0002fExternalInfo & # x0002fTitin & # x0002fannotation.html). ومن ثم فإن هذه المنطقة لها طول كفاف متوقع قدره & # x0224870 نانومتر (0.38 نانومتر & # x0002faa & # x000d7 186 aa). يُظهر الرسم البياني للفصل بين مجالات I27 توزيعًا واسعًا بقيم من 9 إلى 24 نانومتر ، مع اقتراح قمم مميزة عند 11 و 17 نانومتر. الطول الملحوظ لـ PEVK من طرف إلى طرف أصغر بكثير من طول كفافه ، مما يشير إلى أن منطقة PEVK في حالة الاسترخاء ملفوفة. علاوة على ذلك ، فإن منطقة PEVK غير مرئية في الصور المجهرية EM ، مما يشير إلى أن PEVK تشكل بنية أقل إحكاما بكثير من مجال Ig المطوي. درس بوستامانتي وزملاؤه (18 ، 19) المسافة من طرف إلى طرف لجزيئات الحمض النووي الممتصة والمتوازنة على مستوى ثنائي الأبعاد وقرروا أن هذه المسافة ، ص، يمكن حسابها كـ & # x0003c ص 2 & # x0003e = 4 pL، أين ص هو طول المثابرة و إل هو طول كفاف بوليمر WLC. بافتراض أن قياسات EM هي تقريب جيد للقيمة المتوقعة لتوزيع الطول من طرف إلى طرف ، فإننا نقدر نطاقًا واسعًا من أطوال الثبات لقطاعات PEVK (0.2 & # x020132.3 نانومتر).

EM للفرد (I27-PEVK)3 البروتينات. (أ) الممثل (I27-PEVK)3 (قمة و وسط) و I2712 (قاع) الجزيئات كما يراها التظليل الدوار EM. يظهر البولي البروتين على شكل ثلاث جسيمات كروية صغيرة (وحدات I27) ، متصلة على ما يبدو بخيط غير مرئي (PEVK). في المقابل ، الصور ذات الظلال الدوارة لـ I2712 إظهار قضبان صلبة بمتوسط ​​طول 58 نانومتر ، توقع طول مطوي & # x022484.8 نانومتر & # x0002fmodule. الشريط يتوافق مع 50 نانومتر. (ب) يُظهر الرسم البياني لمتوسط ​​المسافة بين وحدات I27 ، المقابلة للمسافة من طرف إلى طرف لـ PEVK ، توزيعًا واسعًا من 9 إلى 24 نانومتر ، مع قمم ظاهرة عند 11 و 17 نانومتر.

على عكس (I27-PEVK)3 متعدد البروتين ، صورة مجهرية إلكترونية مظللة بالدوران لـ I2712 يُظهر البولي البروتين بروتينات مستمرة شبيهة بالقضيب (الشكل & # x200B (الشكل 1 أ 1 قاع) بمتوسط ​​طول 58 نانومتر (غير موضح) ، مما يعطي متوسط ​​طول 4.8 نانومتر للوحدة I27 المطوية ، وهو أكبر قليلاً من تقدير الرنين المغناطيسي النووي البالغ 4.4 نانومتر (20). التباين بين مظهر البروتينات المتعددة I27 ومظهر البروتين المتعدد I27-PEVK (الشكل & # x200B (الشكل 1 1 أ) يدعم وجهة النظر القائلة بأن منطقة PEVK هي إلى حد كبير بولي ببتيد غير مطوي وملفوف. ومع ذلك ، الشكل & # x200B الشكل 1 1 ب يُظهر نطاقًا واسعًا في المسافة من طرف إلى طرف لقطاع PEVK المريح ، مما يعني أن PEVK قد يكون لها توافقات متعددة مع أطوال ثبات مختلفة.

تمت الإشارة أيضًا إلى التشكل غير المطوي لقطاعات PEVK عن طريق الترسيب. (I27-PEVK)3 وأنا 2712 ترسب عند 2.9 ج و 4.2 ج ، على التوالي ، مما يعطي سالأعلى& # x0002fس 2.6 و 2.1. سالأعلى هل س للحصول على كرة مضغوطة غير مملوءة تحتوي على كتلة مكافئة من البروتين. سالأعلى& # x0002fس يعادل F& # x0002fFدقيقة، أين F و Fدقيقة هي معاملات الاحتكاك للبروتين والكرة المكافئة (21 ، 22). تشير القيمة التي تزيد عن 2 إلى جزيء ممتد للغاية. ال سالأعلى& # x0002fس = 2.1 يتوافق مع الهيكل المطول (58 & # x000d7 2.5 نانومتر) لـ I2712. ال سالأعلى& # x0002fس = 2.6 من (I27-PEVK)3 يشير إلى امتداد أكبر. ومع ذلك ، يتم لف جزيء PEVK والطول الإجمالي لـ (I27-PEVK)3 تظهر في صور EM من الشكل & # x200B الشكل 1 1 أقصر من I2712. ومن ثم ، فمن المرجح أن يكون أكبر سالأعلى& # x0002fس تنتج النسبة عن زيادة تعرض البروتين للمذيب. تتوافق بيانات الترسيب مع مقاطع PEVK كونها سلسلة بولي ببتيد غير مطوية إلى حد كبير ، مما يخلق مقاومة هيدروديناميكية كبيرة.

التين & # x200 ب الشكل 2 2 أ يُظهر منحنيات تمديد القوة التي تم الحصول عليها من I2712 بولي بروتين. نظرًا لأن طرف AFM يختار البروتين في مواقع عشوائية ، فإن عدد القمم التي تمت ملاحظتها يعمل كعدد الوحدات النمطية الموجودة في المقطع الذي تم التقاطه. يمكن أن يختلف عدد الوحدات التي يتم التقاطها من واحد إلى 12. يمكن تحديد الطول المطوي للبولي بروتين من خلال تركيب نموذج WLC لمرونة البوليمر (5 ، 6) بالجزء الأولي من منحنى تمديد القوة ، قبل أن يتم فتح أي لوحظ (الشكل. & # x200B (الشكل 2 2 أ, إل0، خط الصلبة). يعتمد الطول المطوي للبروتين المتعدد على عدد الوحدات التي يلتقطها طرف AFM (ن) والطول المطوي لوحدة I27 واحدة (4.4 نانومتر) (20). في اتفاق وثيق مع هذا التوقع ، قطعة أرض إل0 عكس ن يُظهر منحدرًا يبلغ 4.3 نانومتر & # x0002fmodule (الشكل & # x200B (الشكل 2 2) ب، خط الصلبة). ومن ثم ، فإن كلاً من الصور المجهرية الإلكترونية وأجهزة الطيف AFM تعطي قيمًا تتفق بشكل وثيق مع تلك المحددة من بنية الرنين المغناطيسي النووي للوحدة I27.

بصمة مميزة لمجال I27 تتكشف بقوة شد. (أ) تمديد I2712 ينتج البولي بروتين منحنى قوة التمديد يظهر نمط سن المنشار المميز للتكشف. تُظهر منحنيات تمديد القوة عددًا مختلفًا من المنشار ، اعتمادًا على عدد الوحدات التي يلتقطها طرف AFM. تمثل المربعات الحمراء الوحدات التي تم التقاطها في هذه التجربة بالذات. الخطوط الصلبة تناسب البيانات الخاصة بنموذج WLC لمرونة البوليمر. إل0 هو طول الكفاف للبوليروتين المطوي بالكامل عند ظهور الوحدة عند حوالي & # x02248200 pN ، ستتم إضافة 28.1 نانومتر إضافية إلى طول محيط البروتين. (ب) العلاقة بين إل0، يتم تحديده من الملاءمة إلى سن المنشار الأول ، وعدد الوحدات التي يتم التقاطها بواسطة طرف AFM ، محددًا بعدد المنشار. الخط الصلب هو انحدار خطي للبيانات بميل 4.3 نانومتر / وحدة.

ثم استخدمنا نفس الأساليب للتحقيق في الطبيعة الميكانيكية لبروتين PEVK. التين & # x200 ب الشكل 3 3 أ يُظهر العديد من منحنيات تمديد القوة لـ (I27-PEVK)3 بولي بروتين. البصمة المميزة لوحدة I27 هي أنها تتكشف عند & # x02248200 pN ، مما يزيد من طول محيط البروتين بمقدار 28.1 نانومتر (12). & # x200B الشكل 3 3 أ نعرض ثلاثة أنواع من التسجيلات مع واحد (أعلى أثران) ، واثنان (ثلاثة آثار متوسطة) ، وثلاثة (أثران في الأسفل) I27 تتكشف الأحداث ، باستثناء الذروة الأخيرة التي تتوافق مع انفصال الجزيء عن طرف AFM. على عكس البروتينات المتعددة I27 ، تتميز علاقات تمديد القوة لبروتينات I27-PEVK بطول أولي طويل إل0، تتراوح من 50 إلى 230 نانومتر ، وهو ما يتوافق مع تمدد مقطع واحد أو اثنين أو ثلاثة أجزاء PEVK. الآثار الثلاثة في منتصف الشكل. & # x200B الشكل 3 3 أ لها قمتان تتكشفان ، لكنهما لهما قيم مختلفة جدًا لـ إل0، على سبيل المثال 68 نانومتر للواحد الأول ، 133 نانومتر للثاني ، 211 نانومتر للثالث. نظرًا لأن البروتين متعدد البروتين يتم إنشاؤه في نمط بديل I27 & # x0002fPEVK ، إذا لوحظت ثلاث قمم تتكشف I27 ، يجب أن يكون قد تم تمديد قطعتين من PEVK (انظر أقحم & # x200B الشكل 3 3 أ). إذا لوحظ وجود قمتين متفتحتين I27 ، فيجب أن يكون قد تم شد مقطع واحد أو اثنين أو ثلاثة أجزاء من PEVK. إذا لوحظ أن وحدة I27 واحدة فقط تتكشف ، فيمكن أن يكون هناك جزء واحد أو اثنان من أجزاء PEVK التي يتم شدها ولكن ليس هناك ثلاثة أجزاء ، بالاتفاق مع ملاحظاتنا. باستخدام هذا النهج ، يمكننا التأكد من أن مقاطع PEVK ممتدة وأن الخصائص الميكانيكية لـ PEVK يتم تمثيلها بالجزء الأولي من علاقات تمديد القوة ، قبل أن تتكشف أي من وحدات I27.

تحديد وقياس مرونة قطاع PEVK. (أ) تمديد (I27-PEVK)3 ينتج البولي البروتين نمط سن المنشار فقط بعد فاصل أولي طويل ، إل0. تعتبر قمم سن المنشار نموذجية لتكشف مجال I27 لأنها تحدث عند 200 pN وتمدد البروتين بمقدار & # x0224828.1 نانومتر. تُظهر الأحداث ذات حدث واحد فقط I27 قيمتين منفصلتين لـ إل0: & # x0224882 نانومتر أو & # x02248135 نانومتر (أهم أثران). عندما يتم فتح مجالين أو ثلاثة مجالات I27 ، يمكننا قياس قيمة أطول لـ إل0 في & # x02248190 نانومتر. القيم المنفصلة لـ L.0 ينتج عن تمديد مقطع واحد أو اثنين أو ثلاثة أجزاء PEVK قبل حدوث أي وحدة I27 تتكشف. تُظهر المخططات الخاصة بالبروتينات المصاحبة لكل سجل مجموعات مختلفة من الوحدات التي تم التقاطها بواسطة طرف AFM ، حيث تمثل المربعات الحمراء والدوائر الحمراء وحدات I27 وقطاعات PEVK التي يتم التقاطها ، على التوالي. (ب) التردد الرسم البياني للطول الأولي إل0. يظهر التوزيع ثلاث قمم منفصلة بوضوح (ن = 142 تسجيلاً). تعطي النوبات الجاوس توزيعات تبلغ ذروتها عند 82 و 135 و 190 نانومتر.

التين & # x200 ب الشكل 3 3 ب يظهر رسم بياني للطول الأولي إل0. يُظهر الرسم البياني ثلاث قمم مميزة تتمحور حول 82 و 135 و 190 نانومتر. طول كفاف القلب PEVK البشري هو & # x0224870 نانومتر. وبالتالي ، يمكن تفسير هذا التوزيع بافتراض أن الطول الأولي إل0 تحدث تقريبًا كمضاعفات عدد صحيح يبلغ حوالي 70 نانومتر. تشير هذه النتائج بقوة إلى أن الخصائص المرنة للمنطقة الأولية لمنحنيات تمديد القوة الموضحة في الشكل # x200B الشكل 3 3 أ بسبب قطاعات PEVK من (I27-PEVK)3 بولي بروتين.

بعد تحديد طول كفاف مقاطع PEVK القلبية ، قمنا بعد ذلك بقياس طول ثباتها. ينتج عن تمديد مقطع PEVK زيادة رتيبة غير خطية في القوة يمكن وصفها بواسطة نموذج WLC لمرونة البوليمر. ال أقحم & # x200B الشكل 4 4 أ يوضح مثالين على آثار امتداد القوة حيث تمثل الخطوط المنقطة Leverberg غير الخطية & # x02013Marquardt يتناسب مع معادلة WLC. ضمن دقة قوة تبلغ & # x022485 pN ، يناسب نموذج WLC البيانات جيدًا ولا يمكن اكتشاف أي بنية مقاومة ميكانيكية مستقرة ، مما يشير إلى أن PEVK يتصرف كنوابض انتروبية بحتة له هيكل ملف عشوائي. ومع ذلك ، فإن أثرى امتداد القوة لا يتراكبان ، مما يعني أن لهما أطوال ثبات مختلفة. يُظهر الرسم البياني لأطوال الثبات المقاسة (الشكل & # x200B (الشكل 4) 4) توزيعًا واسعًا (ص = 0.3 & # x020132.3 نانومتر) ، في اتفاق معقول مع بيانات EM (الخط الأحمر). توفر هذه النتيجة دليلًا مباشرًا على أن PEVK للقلب يعرض توافقًا متعددًا بمرونة ميكانيكية مختلفة. يمكن أن يكون سبب الاختلاف الصغير في التوزيعات التي تم الحصول عليها من بيانات EM و AFM هو التقريبات المستخدمة لحساب طول ثبات PEVK من المسافة من طرف إلى طرف (19). ومع ذلك ، فمن اللافت للنظر أنهم يتفقون عن كثب ، مما يثبت صحة تقنيات الجزيء المفرد الموضحة هنا.

يُظهر مقطع PEVK من titin القلب العديد من المطابقات الميكانيكية. (أ) الرسم البياني للتردد لطول الثبات المقاس لقطعة PEVK (الأعمدة الرمادية). يتم وصف علاقات القوة والتمديد بدقة بواسطة نموذج WLC لمرونة البوليمر (كما هو موضح في أقحم). يوضح الاتفاق الوثيق بين نموذج WLC والبيانات (داخل & # x022485 pN) أن امتداد مقطع PEVK لا يتضمن تمزق الهياكل المرتبطة بالهيدروجين. يُظهر مقطع PEVK نطاقًا واسعًا من قيم طول الثبات ، بالاتفاق مع أطوال الثبات المحسوبة من التوزيعات من طرف إلى طرف الملحوظة مع EM (الخط الأحمر). (أقحم) اثنان من تسجيلات PEVK التمثيلية بأطوال ثبات مختلفة. في هذين التتبعين فقط الطول الأولي للممتد (I27-PEVK)3 يتم عرض البولي بروتين (قبل الكشف عن مجال I27) (الخطوط الصلبة هي تسجيلات تجريبية ، والرموز المفتوحة هي Levenberg & # x02013Marquardt الملائمة غير الخطية لنموذج WLC للتسجيلات الفردية). يبلغ طول التسجيل الأحمر 0.40 نانومتر ، بينما يبلغ طول التسجيل الأسود 1.08 نانومتر. للمقارنة ، تم تطبيع التسجيل الأحمر (بطول كفاف 207 نانومتر) ليكون له نفس طول الكنتور مثل التتبع الأسود (140 نانومتر). (ب) الرسم البياني للتردد لطول الثبات المقاس لقطاعات PEVK لقطعة واحدة (I27-PEVK)3 الجزيء خلال دورات التمدد والاسترخاء المتكررة. يتم توزيع طول الثبات بشكل ضيق حول 1.1 نانومتر وهو نفسه بالنسبة للامتداد (الأعمدة الرمادية) وآثار الاسترخاء (الأعمدة الحمراء) ، مما يدل على عدم وجود تغيير يمكن اكتشافه في طول الثبات خلال هذه الدورات. يعود سبب التشتت إلى هامش الخطأ للملاءمة للبيانات. (أقحم) تسجيلان متتاليان للتمدد (الأسود) والاسترخاء (أحمر). لم يلاحظ أي تباطؤ بين التمدد والاسترخاء ، مما يشير إلى أن هذه العملية قابلة للعكس تمامًا.

لقد بحثنا أيضًا في الخصائص التبديدية لـ (I27-PEVK)3 بولي بروتين. ال أقحم & # x200B الشكل 4 4 ب يُظهر دورة استرخاء تمدد واحدة لقطاعات PEVK. في ظل هذه الظروف ، كان منحنى تمديد القوة قابلاً للانعكاس تمامًا لأنه يمكن فرض آثار للأمام (باللون الأسود) والخلف (باللون الأحمر) ، على عكس التباطؤ الذي لوحظ أثناء الكشف عن مجالات Ig (8 & # x0201310 ، 12). يُظهر طول الثبات المقاس من نفس الجزيء خلال العديد من دورات استرخاء التمدد المتتالية توزيعًا أضيق بكثير (من 0.8 إلى 1.7 نانومتر) ، على عكس التوزيع الواسع لأطوال الثبات المقاسة على جزيئات مختلفة (الشكل & # x200 ب (الشكل. .4 4 أ). تشير هذه النتيجة إلى أن جزيئات PEVK الفردية تحتفظ بتشكيلاتها المرنة المميزة من خلال العديد من دورات استرخاء التمدد ، ولا يمكن تحويل هذه المطابقات المميزة بالقوة.

قدمت الدراسات السابقة لـ PEVK نظرة ثاقبة على الخصائص الميكانيكية لهذا الجزء (3 ، 7 ، 8 ، 23 & # x0201325). ومع ذلك ، فإن المرونة المتوسطة للمجموعة في اللييفات العضلية السليمة (3 ، 7) وعدم اليقين في عدد الجزيئات في تجارب الجزيء الفردي (8) ربما حالت دون اكتشاف المطابقات المتعددة لـ PEVK. يوضح النطاق الواسع من المطابقات الميكانيكية لـ PEVK القلبية التي لوحظت في دراساتنا فائدة & # x0201cfingerprint & # x0201d في تجارب الجزيء الفردي وتوفر نهجًا عامًا لدراسة الخصائص الميكانيكية والتوافق مع البروتينات الأخرى.

من المعروف جيدًا أن تضمين بقايا l -prolyl في سلسلة polypeptide له تأثيرات هيكلية كبيرة. تحتوي سلاسل Polyproline على نوعين من مطابقة البنية الثانوية المتميزة المسمى polyproline type I و polyproline type II (PPII) helices. تحدث التحولات التعاونية بين هذين المطابقين بسبب أزمرة البرولين حيث يؤدي التغيير من عبر إلى رابطة الدول المستقلة إلى الانتقال من النوع الثاني إلى النوع الأول اللولب (26). ينتج عن الأزمرة من trans إلى cis أطوال مختلفة بشكل كبير من طرف إلى طرف ، مما يشير إلى أطوال ثبات مختلفة (27 ، 28). كشفت الدراسات الحديثة للقرص المضغوط والرنين المغناطيسي النووي ثنائي الأبعاد عن وجود مطابقة لولبية PPII قصيرة في وحدة PEVK بطول 28 أأ من تيتين الجنين البشري (29 ، 30). نظرًا لأن فرق الطاقة بين بقايا trans- و cis-prolyl هو فقط 1 & # x020132 kcal & # x0002fmol (31) ، إذا كان جزء من PEVK PPII يغير الشكل اللولبي الناجم عن انتقال trans-cis ، يمكن أن يفسر هذا بياناتنا بسهولة. نظرًا لأن تشكّل رابطة الدول المستقلة أقصر من الترانس ، فقد يتوقع المرء أن يؤدي تمديد جزيء PEVK إلى إجبار جميع بقايا cis l -prolyl على الشكل التحولي الأطول. ومع ذلك ، فإن حاجز طاقة التنشيط من رابطة الدول المستقلة إلى العابرة كبير ، 21 كيلو كالوري & # x0002fmol (32) ، والكسب في الطول صغير (1.0 & # x0212b). قدرنا القوة الأكثر احتمالية المطلوبة للانتقال المدفوع ميكانيكيًا من رابطة الدول المستقلة إلى العبور وفقًا لـ (33 ، 34) ،

أين الخامس هو معدل التحميل (200 pN & # x0002fs) ، & # x00394xش هي المسافة بين رابطة الدول المستقلة والحالة الانتقالية ، و & # x003b1ا هو معدل الأزمرة من رابطة الدول المستقلة إلى العابرة في غياب القوة. استخدام قيمة لـ & # x003b1ا من 2 & # x000d7 10 & # x022123 s & # x022121 (35) ، نحسب أن انتقال رابطة الدول المستقلة سيحدث عند & # x02248600 pN وبالتالي من غير المحتمل أن يحدث في ظل ظروفنا التجريبية. قد يفسر هذا سبب ملاحظتنا نطاقًا واسعًا من أطوال الثبات في جزيئات PEVK المختلفة (كميات مختلفة من cis ومخلفات l -prolyl) التي لا يمكن تحويلها بالقوة.

بالإضافة إلى أشكال رابطة الدول المستقلة والأشكال العابرة لبقايا l -prolyl ، لاحظ Schimmel و Flory (36) أن المطابقتين المسموح بهما لبقايا ترانس برولايل يمكن أن يغير بشكل كبير من انضغاط سلسلة البولي ببتيد. على سبيل المثال ، تبين أن سلسلة البوليالانين التي تحتوي على 10 & # x00025 من بقايا l -prolyl المعزولة تغير طولها من طرف إلى طرف بمعامل & # x022481.6 عندما تغيرت جميع بقايا البرولايل العابرة بين هذه الدوارات. علاوة على ذلك ، نظرًا لعدم وجود تغيير في طول محيط البولي ببتيد بين هذين المطابقين ، لا يمكن تحويلهما من خلال القوة المطبقة. ومن ثم ، فإن سلاسل PEVK ذات النسب المختلفة من المطابقين لبقايا البرولايل العابرة يمكن أن تفسر أيضًا نتائجنا.

ما هي القوى أثناء تجميع البروتين التي يمكن أن تسبب مثل هذا الاختلاف في أيزومرات البرولين من جزيء إلى آخر مما يؤدي إلى جزيئات PEVK ذات المرونة المختلفة جدًا؟ صنعت البروتينات المهندسة لدينا في البكتيريا وعادة ما تستخدم بعد عدة أيام من تنقيتها. قد يتوقع المرء أن يكون اتجاه الأزمرة هو نفسه لكل برولين وبالتالي متوسطه تقريبًا في كل جزيء. ومع ذلك ، يجب على المرء أن ينظر إلى البروتين ككل. إذا بدأ تشكيل لولب PPII ، فمن المحتمل أنه سيفضل الروتامر عبر البرولين ، في تفاعل الطي التعاوني. ومن ثم ، يمكن لجزيئات PEVK المختلفة الحصول على مجموعات مستقرة ، ولكنها معقدة ، من PPII والتطابقات الملفوفة.

نقترح أن يتصرف PEVK القلبي باعتباره زنبركًا حتميًا له هيكل ملفوف بشكل عام مع حلزون PPII وبنية غير مرتبة تتعايش داخل الملف. نظرًا لأن الهياكل الحلزونية PPII يتم إملاءها في الغالب من خلال التأثير الفراغي ، فإن مرونة PEVK تظل غير متوقعة. The conformation and mechanical properties of PEVK depend on the available conformers of the l -prolyl residue in the PEVK sequence. Because these conformers can be switched enzymatically, it is possible that the elasticity of PEVK, في الجسم الحي, can be regulated by yet unknown signaling mechanisms.


The reference genome is not a baseline

The current reference genome is a type specimen

Although the reference genome is meant to be a standard, what that means in a practical sense is not clearly defined. For example, the allelic diversity within the reference genome is not an average of the global population (or any population), but rather contains long stretches that are highly specific to one individual. Of the 20 donors the reference was meant to sample from, 70% of the sequence was obtained from a single sample, ‘RPC-11’, from an individual who had a high risk for diabetes [27]. The remaining 30% is split 23% from 10 samples and 7% from over 50 sources [28]. After the sequencing of the first personal genomes in 2007 [29, 30], the emerging differences between genomes suggested that the reference could not easily serve as a universal or ‘gold-standard’ genome (see Box 1 for definitions). This observation is easily extended to other populations [31,32,33,34], where higher diversity can be observed. The HapMap project [35, 36] and the subsequent 1000 Genomes Project [37] were a partial consequence of the need to sample broader population variability [38]. Although the first major efforts to improve the reference focused on the need to fill in the gaps, work is now shifting towards incorporating diversity, through the addition of alternative loci scaffolds and haplotype sequences [39]. But just how similar to a personal genome is the current reference? We performed a short series of analyses to answer this question (Fig. 1), using the 1000 Genomes Project samples. Looking first at the allele frequencies (AF) of known variants, we found that around two million reference alleles have population frequencies of less than 0.5, indicating that they are the minor allele (dark blue line in Fig. 1a). This might seem high for a reference. In fact, the allelic distribution of the current reference is almost identical to the allelic distributions of personal genomes sampled from the 1000 Genomes Project (light blue lines in Fig. 1a). In practice, the current reference can be considered a well-defined (and well-assembled) haploid personal genome. As such, it is a good type specimen, exemplifying the properties of the individual genomes. This means, however, that the reference genome does not represent a default genome any more than any other arbitrarily chosen personal genome would.

The reference genome is a type specimen. أ Cumulative distributions of variants in the reference genome and those in personal/individual genomes. If we collapse the diploid whole genomes genotyped in the 1000 Genomes Project into haploid genomes, we can observe just how similar the reference is to an individual genome. First, taking population allele frequencies from a random sample of 100 individual genomes, we generated new haploid ‘reference’ sequences. We replaced the alleles of the reference genome with the personal homozygous variant, and a randomly chosen heterozygous allele. For simplicity, all calculations were performed against the autosomal chromosomes of the GRCh37 assembly and include only single nucleotide bi-allelic variants (i.e., only two alleles per single nucleotide polymorphism (SNP)). ب Cumulative distributions of allele frequencies for variants called in 100 randomly chosen personal genomes, computed against the reference genome. Here, the presence of a variant with respect to the reference is quite likely to mean that the reference itself has the ‘variant’ with respect to any default expectation, particularly if the variant is homozygous

Reference bias

Because the reference genome is close to being a type specimen, it can distort results where it’s sequence is not very typical. In alignment, reference bias refers to the tendency for some reads or sequences to map more readily to the reference alleles, whereas reads with non-reference alleles may not be mapped or mapped at lower rates. In RNA-seq-based alignment and quantification, reference bias has a major impact when differential mapping matters (such as in allele-specific expression), but can be overcome by the use of personal genomes or through the filtering of biased sites [40,41,42]. In variant calling, reference bias can be more important. Alignment to the reference to infer variation related to disease is still a step in most analyses, and is crucial in clinical assignments of variant significance and interpretation [43, 44]. In these cases, reference bias will induce a particular error. Variant callers might call more ‘variants’ when the reference alleles are rare or could fail to call variants that are rare but also shared by the reference [45,46,47,48]. Owing to the presence of rare alleles in the reference genome, some known pathogenic variants are easily ignored as benign [25]. A variant called with respect to the reference genome will be biased, reflecting the properties of the reference genome rather than properties that are broadly shared in the population. Indeed, continuing with our analysis (Fig. 1b), if we compare the variant calls within personal genomes against the reference, we find that close to two-thirds of the homozygous variants (blue lines) and one-third of the heterozygous variants (green lines) actually have allele frequencies above 0.5. Variation with respect to the reference is quite likely to indicate the presence of a ‘variant’ in the reference genome with respect to any default expectation, particularly if that ‘variant’ is homozygous.


الاستنتاجات

It is clear that there is much to learn about the nature of protein structure dynamics that is not addressed in the static information contained in PDB. The intermediate structures representing a protein as it moves from one conformation to another may yield much information about how a protein functions. Experimental techniques are inadequate for this task due to practical and technological limitations. For this reason, structural biology is in great need of algorithms which can accurately predict the intermediate structures as a protein undergoes a conformational change.

While other morphing algorithms require computationally expensive energy and elastic network modeling calculations, our morphing algorithm is based on a few simple observations of protein structure, and therefore produces multiple intermediate conformations very quickly. Our intermediate structures represent possible protein structures, and demonstrate the motion of a protein as it changes between conformations. In the case of morphing between homologs, the intermediate structures give us clues to how protein structures have evolved.

The morphed structures also show promise in the area of virtual screening. Most techniques limit protein flexibility to the side chain atoms, and may allow limited flexibility of the substrate. Our morph produces intermediate structures which are hypotheses for possible backbone movements. For this reason, some ligands bound more favorably to our intermediate structures than the solved structures. These are strong implications for the potential of morphs in guiding drug development.

Like all other approaches, our algorithm also has limitations. Linear interpolation, with only small corrections, prevents our method from correctly producing a morph for proteins with very large or complex movements. Many of these morphs could be solved by allowing a larger movement from the first approximation (a larger lattice), or allowing higher granularity of possible C α positions (more points in each lattice) but the time cost would be significant. Clearly, in protein morphing there is a trade-off between speed and accuracy.


Just released: Addgene's Plasmids 101 eBook

And now for some exciting news. You can now download Addgene's new eBook! Our goal was to create a one-stop reference guide for plasmids. We've combined our Plasmids 101 blog posts and additional resources into one downloadable PDF that you can save on your desktop. The Plasmids 101 eBook is designed to educate all levels of scientists and plasmid lovers and serves as an introduction to plasmids, allowing you to spend less time researching plasmid basic features and spend more time developing the clever experiments and innovative solutions necessary for advancing the field.

1. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Pelletier et al (Nature. 1988 Jul 28334(6180):320-5.) PubMed.

2. A segment of the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation. Jang et al. (J Virol. 1988 Aug62(8):2636-43.) PubMed.

3. Highly Efficient Multicistronic Lentiviral Vectorswith Peptide 2A Sequences. Ibrahimi et al. ( Hum Gene Ther. 2009 Aug20(8):845-60. doi: 10.1089/hum.2008.188. ) PubMed .

4. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. Kim et al ( PLoS One. 20116(4):e18556. doi: 10.1371/journal.pone.0018556. Epub 2011 Apr 29. ) PubMed .

5. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Holst et al (Nat Immunol. 2008 Jun9(6):658-66. doi: 10.1038/ni.1611. Epub 2008 May 11.) PubMed .

Read more Plasmids 101 posts or browse Addgene's Plasmid Guide for more molecular biology and cloning information.


شاهد الفيديو: الحلقة الثامنة والعشرون. تطبيقات في علم الوراثة. (كانون الثاني 2022).