معلومة

11.5 ب: تطوير نظام الخلايا الليمفاوية المزدوجة - علم الأحياء


تنشأ الخلايا الليمفاوية من سلف مشترك في عملية تعرف باسم استسقاء الدم.

أهداف التعلم

  • افحص تطور الخلايا الليمفاوية المزدوجة

النقاط الرئيسية

  • الخلايا البائية والخلايا التائية هي الأنواع الرئيسية للخلايا الليمفاوية.
  • تنضج الخلايا البائية لتصبح الخلايا الليمفاوية البائية في نخاع العظام ، بينما تهاجر الخلايا التائية وتنضج في عضو مميز يسمى الغدة الصعترية.
  • بعد النضج ، تدخل الخلايا الليمفاوية الدورة الدموية والأعضاء اللمفاوية الطرفية (مثل الغدد الليمفاوية والطحال) حيث تقوم بمسح مسببات الأمراض الغازية و / أو الخلايا السرطانية.
  • تتمايز الخلايا الليمفاوية المشاركة في المناعة التكيفية (أي الخلايا البائية والتائية) بشكل أكبر بعد التعرض لمستضد لتشكيل الخلايا الليمفاوية المستجيبة والذاكرة.

الشروط الاساسية

  • اللمفاويات: نوع من خلايا الدم البيضاء أو الكريات البيض تنقسم إلى مجموعتين رئيسيتين ومجموعة خالية: الخلايا الليمفاوية البائية ، التي تنتج أجسامًا مضادة في الاستجابة المناعية الخلطية ، والخلايا اللمفاوية التائية ، التي تشارك في الاستجابة المناعية بوساطة الخلية ، والخلايا اللمفاوية التائية التي تشارك في الاستجابة المناعية الخلطية. مجموعة فارغة تحتوي على خلايا قاتلة طبيعية وخلايا سامة للخلايا تشارك في الاستجابة المناعية الفطرية.
  • خلايا الدم البيضاء: خلية دم بيضاء.
  • تكون الدم: هيماتوبويزيس هو تكوين مكونات خلايا الدم من خلية جذعية سلفية مشتركة.

خلايا الجهاز المناعي التكيفي هي نوع من الكريات البيض تسمى الخلايا الليمفاوية. يحتوي جسم الإنسان على حوالي 2 تريليون خلية ليمفاوية ، تشكل 20-40٪ من خلايا الدم البيضاء (WBCs) ؛ كتلتها الإجمالية هي نفسها تقريبا مثل الدماغ أو الكبد. يحتوي الدم المحيطي على 20-50٪ من الخلايا الليمفاوية المنتشرة. يتحرك الباقي داخل الجهاز اللمفاوي. الخلايا البائية والخلايا التائية هي الأنواع الرئيسية للخلايا الليمفاوية.

تمايز الخلايا البائية والخلايا التائية

تتمايز الخلايا الجذعية للثدييات إلى عدة أنواع من خلايا الدم داخل نخاع العظام. تسمى هذه العملية تكون الدم. خلال هذه العملية ، تنشأ جميع الخلايا الليمفاوية من سلف ليمفاوي شائع قبل التمايز إلى أنواع الخلايا الليمفاوية المتميزة. يتبع تمايز الخلايا الليمفاوية إلى أنواع يمكن تمييزها مسارات مختلفة بطريقة هرمية وكذلك بطريقة بلاستيكية أكثر. يُعرف تكوين الخلايا الليمفاوية باسم تكون اللمفاويات. تنضج الخلايا البائية لتصبح الخلايا الليمفاوية البائية في نخاع العظام ، بينما تهاجر الخلايا التائية وتنضج في عضو مميز يسمى الغدة الصعترية. بعد النضج ، تدخل الخلايا الليمفاوية الدورة الدموية والأعضاء اللمفاوية الطرفية (مثل الغدد الليمفاوية والطحال) حيث تقوم بمسح مسببات الأمراض الغازية و / أو الخلايا السرطانية.

مزيد من التمايز

تتمايز الخلايا الليمفاوية المشاركة في المناعة التكيفية (أي الخلايا البائية والتائية) بشكل أكبر بعد التعرض لمستضد ؛ أنها تشكل الخلايا الليمفاوية المستجيب والذاكرة. تعمل الخلايا الليمفاوية المستجيبة على القضاء على المستضد ، إما عن طريق إطلاق الأجسام المضادة (في حالة الخلايا البائية) ، أو الحبيبات السامة للخلايا (الخلايا التائية السامة للخلايا) أو عن طريق إرسال إشارات إلى خلايا أخرى في الجهاز المناعي (الخلايا التائية المساعدة). تبقى خلايا الذاكرة في الأنسجة المحيطية وتدور في الدورة الدموية لفترة طويلة جاهزة للاستجابة لنفس المستضد عند التعرض المستقبلي.


خلايا CD4 + و CD8 + T لها أدوار متعارضة في تطور سرطان الثدي ونتائجه

قدم مفهوم العلاج المناعي للسرطان رؤى مهمة تشير إلى وظائف مزدوجة لجهاز المناعة أثناء بدء السرطان وتطوره. ومع ذلك ، لا تزال ديناميكيات وأدوار خلايا CD4 + و CD8 + T في التسبب في الإصابة بسرطان الثدي غير واضحة. استخدمنا هنا نموذجين لسرطان الثدي من الفئران (4T1 و E0771) وأظهرنا أن كلا من خلايا CD4 + و CD8 + T تمت زيادتهما ومشاركتهما في الاستجابات المناعية ، ولكن مع اتجاهات ديناميكية متميزة في تطور سرطان الثدي. بالإضافة إلى زيادة عدد الخلايا ، غيرت خلايا CD4 + T مجموعاتها الفرعية السائدة من Th1 في المراحل المبكرة إلى خلايا Treg و Th17 في المراحل المتأخرة من تطور السرطان. قمنا أيضًا بتحليل تسلل الخلايا CD4 + و CD8 + T في أنسجة سرطان الثدي الأولية من مرضى السرطان. لاحظنا أن خلايا CD8 + T هي مجموعة الخلايا المؤثرة الرئيسية التي تتوسط مناعة فعالة ضد الورم مما يؤدي إلى نتائج سريرية أفضل. في المقابل ، فإن خلايا CD4 + T داخل الورم لها آثار تنبؤية سلبية على نتائج مرضى سرطان الثدي. تشير هذه الدراسات إلى أن خلايا CD4 + و CD8 + T لها أدوار متعارضة في تطور سرطان الثدي ونتائجه ، مما يوفر رؤى جديدة ذات صلة بتطوير مناهج العلاج المناعي الفعال للسرطان.

الكلمات الدالة: خلايا CD4 + T خلايا CD8 + T خلايا Th17 خلايا ورم الثدي في البيئة المكروية الخلايا التائية التنظيمية.

بيان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مالي أو تجاري في المصالح.

الأرقام

الشكل 1. تراكم كل من CD4 + ...

الشكل 1. تراكم كل من CD4 + و CD8 + T في TILs ...

الشكل 2. ديناميات تسلل الورم CD4 + ...

الشكل 2. ديناميات مجموعات الخلايا الفرعية CD4 + T التسلل إلى الورم في نماذج سرطان الثدي لدى الفأر

الشكل 3. توزيعات CD4 + T ...

الشكل 3. توزيع مجموعات فرعية من الخلايا التائية CD4 + في الدم المحيطي وتصريف اللمف ...

الشكل 4. تراكم CD4 + و ...

الشكل 4. تراكم خلايا CD4 + و CD8 + T في سرطان الثدي السريري ...

الشكل 5. الأدوار المميزة للورم CD4 المتسلل إلى الورم ...

الشكل 5. الأدوار المميزة لخلايا CD4 + و CD8 + T التي تتسلل إلى الورم في التنبؤ ...


يحفز تثبيط G9A و EZH2 المزدوج الاستجابة المناعية المضادة للورم في سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة

يرتبط تشخيص سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSC) ارتباطًا مباشرًا بوجود الخلايا الليمفاوية داخل الورم. ومع ذلك ، فإن العلاج المناعي للسرطان لم يحقق فائدة مجدية للبقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من HGSC. إسكات الجينات الجينية للجينات المناعية متورط في التهرب المناعي في HGSC وإعادة التعبير عن هذه الجينات يمكن أن يعزز إزالة المناعة للورم. اكتشفنا أن التثبيط المتزامن للهيستون ميثيل ترانسفيراز G9A و EZH2 ينشط محور CXCL10-CXCR3 ويزيد من توجيه الخلايا الليمفاوية المستجيبة داخل الورم والخلايا القاتلة الطبيعية أثناء قمع خلايا FoxP3 + CD4 T المعززة للورم. تسبب مثبط G9A / EZH2 المزدوج HKMTI-1-005 في تغييرات الكروماتين التي أدت إلى تنشيط النسخ لشبكات الجينات المناعية ، بما في ذلك إعادة التعبير عن عناصر من عائلة الفيروسات الرجعية الذاتية ERV-K. الأهم من ذلك ، أدى العلاج باستخدام HKMTI-1-005 إلى تحسين بقاء تحمل الفئران TRP53 -/- خالية من أورام المبيض ID8 وأدت إلى تقليل عبء الورم.

تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط G9A و EZH2 في سرطان المبيض يغير البيئة المكروية المناعية ويقلل من نمو الورم ، وبالتالي يضع تثبيطًا مزدوجًا لـ G9A / EZH2 كاستراتيجية للتطور السريري.


لقاح ثنائي المستضد Ad5 COVID-19 الذي يتم تسليمه كقاح رئيسي تحت الجلد بالإضافة إلى الخلايا التائية المهيمنة Th1 والاستجابات الخلطية في الفئران CD-1

استجابة للحاجة إلى لقاح فعال ومستقر حرارياً لـ COVID-19 يمكنه استحضار استجابات خلطية وخلايا تائية خلوية ، قمنا بتطوير لقاح من النمط المصلي 5 (hAd5) لفيروس COVID-19 البشري ثنائي المستضد في المستحضرات. مناسب للولادة تحت الجلد أو الأنف أو الولادة عن طريق الفم. يعبر اللقاح عن كل من بروتينات SARS-CoV-2 spike (S) و nucleocapsid (N) باستخدام منصة hAd5 مع حذف متواليات E1 و E2b و E3 (hAd5 [E1- و E2b- و E3-]) وهي فعالة حتى في وجود مناعة hAd5. في اللقاح ، تم تعديل S (S-Fusion) لتحسين عرض سطح الخلية لاستنباط استجابات خلطية ويتم تعديل N باستخدام مجال تحفيز الخلايا التائية المحسن (N-ETSD) لتوجيه N إلى المسار الداخلي / الليزوزومي لزيادة عرض MHC الأول والثاني. أظهرت الدراسات الأولية باستخدام التطعيم الأساسي والتحصين المعزز تحت الجلد لفئران CD-1 أن لقاح hAd5 S-Fusion + N-ETSD يؤدي إلى استجابات الخلايا التائية السائدة 1 (Th1) والخلايا التائية السائدة لكل من S و N. ثم قمنا بمقارنة SC مع التطعيم الأساسي IN مع إما SC أو IN دفعة رئيسية بعد SC و دفعة IN بعد IN Prime. تكشف هذه الدراسات أن تعزيز IN Prime / IN فعال في توليد استجابات خلطية مهيمنة Th1 لكل من S و N مثل التوليفات الأخرى ، لكن رئيس SC مع تعزيز IN أو SC يثير استجابات أكبر للخلايا التائية. في دراسة ثالثة لتقييم قوة طريقتين للتسليم عند استخدامهما معًا ، استخدمنا SC plus IN prime مع أو بدون دفعة ووجدنا أن العدد الأولي المدمج وحده فعال مثل العدد الأولي المدمج مع إما SC أو تعزيز في توليد كل من الاستجابات الخلطية والخلايا التائية. تُظهر النتائج هنا في الفئران CD-1 أن SC و IN التسليم الأولي فقط لديه القدرة على توفير مناعة واسعة - بما في ذلك المناعة المخاطية - ضد SARS-CoV-2 وتدعم المزيد من الاختبارات لنهج التسليم هذا في نماذج حيوانية إضافية وسريرية. محاكمات.

بيان المصالح المتنافسة

جميع المؤلفين الذين ينتمون إلى ImmunityBio لهم دور في تطوير اللقاح الموصوف.


التعرف الدقيق على الورم بواسطة الخلايا التائية مع دوائر استشعار المستضد التوافقية

يمكن إعادة توجيه الخلايا التائية لقتل الخلايا السرطانية باستخدام مستقبلات المستضدات الكيميرية (CARs) أو مستقبلات الخلايا التائية (TCRs). ومع ذلك ، فإن هذا النهج مقيد بندرة المستضدات الفردية الخاصة بالورم. يمكن أن يسبب استهداف المستضدات الموجودة أيضًا في الأنسجة التي تعيش في الخارج آثارًا ضائرة تهدد الحياة. تتمثل إحدى الطرق القوية لتعزيز نشاط ON-target للخلايا التائية العلاجية في تصميمها بحيث تتطلب مستضدات اندماجية. هنا ، نقوم بتصميم دائرة خلية تائية نشطة اندماجيًا حيث يحفز مستقبل الشق الاصطناعي لمستضد واحد التعبير عن CAR لمولد ضد ثانٍ. هذه الخلايا التائية ذات المستقبلات المزدوجة والبوابة يتم تسليحها وتنشيطها فقط في وجود خلايا ورم مستضد مزدوج. تُظهر هذه الخلايا التائية تمييزًا علاجيًا دقيقًا في أورام المستضد الفردي التي تحافظ على الجسم الحي بينما تقضي بكفاءة على أورام "مرض" المستضد التوافقي. يفتح هذا النوع من دارات المستقبلات المزدوجة الدقيقة الباب أمام التعرف المناعي على نطاق أوسع من الأورام. ملخص الفيديو.

حقوق النشر © 2016 Elsevier Inc. جميع الحقوق محفوظة.

الأرقام

الشكل 1. تصميم استشعار المستضد الاندماجي ...

الشكل 1. تصميم دوائر استشعار المستضد الاندماجي في الخلايا التائية باستخدام SynNotch المنظم بالتسلسل ...

الشكل 2. تعبير CAR المنظم SynNotch - ...

الشكل 2. تعبير CAR المنظم SynNotch - متطلبات مستضد اندماجي لتنشيط خلية Jurkat T

6 ساعات. بعد ذلك ، يحدث تنشيط الخلية T عن طريق تنشيط CAR (يتم مراقبته بواسطة تعبير CD69) بعد ذلك مع تأخر عدة ساعات أخرى (t1/2

13 ساعة). تظهر الرسوم البيانية FACS للتعبير CAR في الشكل S1B. (و) Timecourse من AND- بوابة تعطيل الخلايا التائية عند إزالة يجند synNotch. تم تحفيز خلايا Jurkat T التي تعبر عن دائرة AND-gate لمدة 24 ساعة بواسطة الجسم المضاد α-Myc المرتبط باللوح (يحتوي مستقبل synNotch على علامة Myc خارج الخلية). يشير START إلى الوقت الذي تمت فيه إزالة الخلايا من الترابط ، وتمت مراقبة اضمحلال تعبير CAR الموسوم GFP (t1/2

8 ساعات). تظهر الرسوم البيانية FACS للتعبير CAR في الشكل S1C.

الشكل 3. تعبير CAR المنظم SynNotch في ...

الشكل 3. تعبير CAR المنظم SynNotch في الخلايا التائية الأولية البشرية - التحكم في المستضد التوافقي ...

الشكل 4. مستقبلات SynNotch تدفع الورم المترجمة ...

الشكل 4. مستقبلات SynNotch تحرك الورم الموضعي CAR التعبير في الجسم الحي

الشكل 5. قتل ورم المستضد الاندماجي الانتقائي ...

الشكل 5. قتل ورم المستضد الاندماجي الانتقائي في الجسم الحي بواسطة SynNotch Gated CAR Expression

الشكل 6. التحكم في مستقبلات SynNotch وتحديد موقعها ...

الشكل 6. التحكم في مستقبلات SynNotch وتوطين استجابة الخلايا التائية للسيارة من أجل العلاج المناعي الدقيق


متطلبات المفاعلات الحيوية لثقافة الخلايا الليمفاوية

على الرغم من أن كل عملية علاج خلوي لها عناصر فريدة ، إلا أنه ليس من العملي تصميم أجهزة متخصصة لكل منتج محدد. بدلاً من ذلك ، يجب تجميع منتجات ACT وفقًا لخصائص العملية المشتركة ، وتحديد الاستراتيجيات والتقنيات التي تناسب بشكل أفضل كل فئة ككل [40]. في هذا الصدد ، يمكن إجراء ACT باستخدام مبدأين عامين: ذاتي وخيفي. في الإعداد الذاتي ، يتم إنتاج دفعة بشكل فردي من خزعة المريض ، وعزل واستنبات مجموعة الخلايا محل الاهتمام. في سير العمل الخيفي ، يعتبر مصدر الخلية منصة عالمية للمانحين مع خلايا قابلة للتمدد بشكل كبير ولها متطلبات مقياس مماثلة لتصنيع البروتينات المشتقة من الخلايا وقد يستهدف منتج الخلية العديد من المرضى [25]. من ناحية العملية ، فإن زيادة حجم الوعاء وضمان أداء الثقافة (توسيع النطاق) مرتبط بالنهج الخيفي ، في حين أن موازاة عدة وحدات مستقلة (مقياس التدرج) بشكل عام هو الهدف في تحسين العلاج الذاتي [22]. لا يُتوقع أن يتجاوز حجم الدُفعة الذاتية أكثر من بضعة لترات من الحجم ، بسبب الكمية المحدودة لمواد البدء وحساسية الوقت للخلايا للاحتفاظ بوظائفها. وبالتالي ، لا يعد توسيع النطاق الذاتي مفيدًا ولا يزال التوسع في مجموعات متعددة يتطلب تقييمًا شاملاً للقدرات التقنية [35]. يؤدي هذا الإعداد الدقيق للعلاج بالخلايا الذاتية إلى تطوير العمليات الحيوية نحو الأتمتة [11 ، 25] ، حيث يجب أن تعوض المنصة الذاتية المثالية عن تأثيرات الظروف الثقافية المتغيرة على أداء CQA [40]. من ناحية أخرى ، يتطلب الإعداد الخيفي مستويات التلقيح المناسبة مع الحد الأدنى من تكيف البذور لتعظيم نتيجة التوسع. لذلك ، فإن إمكانية وجود مجموعة من السفن قابلة للمقارنة هندسيًا وديناميكيًا أمر وثيق الصلة [41]. وبنفس الطريقة ، فإن تحقيق استنساخ متسق للعملية ضروري لمنصة خيفية موحدة وآمنة ، وبالتالي ، فإن تطوير العمليات الحيوية الخيفية يتم توجيهه في الغالب نحو التحكم في العملية بدلاً من أتمتة سير العمل. لتسخير الإمكانات الكاملة للمفاعل الحيوي ، يجب أن يتلاءم تصميمه وتطبيقه مع تحديات زراعة الخلايا الليمفاوية والمكملات اللازمة لنموها. هذه ، في رأي المؤلفين ، وبناءً على أطر المتطلبات السابقة [14 ، 19 ، 25 ، 34 ، 35 ، 42] ، المعايير الرئيسية التي يجب الوفاء بها من خلال منصة ثقافية لـ ACT.

حجم السفينة المناسب وقابلية التوسع

غالبًا ما تتطلب العلاجات القائمة على الخلايا تطبيق كميات هائلة من الخلايا (10 8-10 10) على المرضى ، وبالتالي فإن المساحة المطلوبة لنموهم تعد قيدًا عمليًا. بافتراض أن كثافة المزرعة من 10 6 إلى 10 7 خلايا / مل (قيمة عالية لـ ACT) ، فإنها تتطلب حجمًا يبدأ من بضعة ملليلتر حتى عشرات اللترات أثناء الاستزراع [43]. يجب أن يكون مقياس المفاعل الحيوي المتاح مرنًا بما يكفي لاستيعاب نطاق نمو الخلايا بشكل كامل عبر جميع الدفعات الممكنة ، ولتعويض تقلب النمو المحتمل المتوقع من المصدر [25]. لتحقيق ذلك ، يلزم وجود مزارع ذات كثافة خلية عالية جدًا أو إنتاج على نطاق صناعي قادر على الحفاظ على ظروف استزراع موحدة [39]. تتضمن بعض عمليات التوسع الحالية مرحلة أولية حيث يتم تنشيط الخلايا وتكاثرها بسرعة في أنظمة ثابتة ، مما ينتج عنه خلايا كافية لتلقيح المفاعل الحيوي. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري وجود مساحة كافية من المفاعلات الحيوية للتوسع الفعلي.

الامتثال GMP

لتجنب التلوث المتبادل (بين دفعات مختلفة أو مرضى) والتلوث الميكروبيولوجي ، يجب استخدام أنظمة مغلقة (أكياس ، مجموعات تمدد ، قوارير) ، حاضنات وأغطية [36]. يجب أن تضمن المفاعلات الحيوية التعقيم بالحفاظ على نظام مغلق [19]. كل خطوة من خطوات التلاعب (مثل التلقيح ، التنشيط ، التنبيغ ، تغيير الوسائط ، التحفيز ، أخذ العينات ، الغسيل) تخلق خطرًا للخطأ والتلوث الذي قد يؤدي إلى فشل التشغيل [36]. لهذا الغرض ، قد تمثل "مجموعات" إنتاج الخلايا ذات الاستخدام الفردي والمغلقة والتي يمكن التخلص منها استراتيجية التصميم المرغوبة لبروتوكولات تصنيع العلاج بالخلايا الخاصة بالمريض [44] ، خاصةً إذا كان من الممكن تصميم هذه المجموعات من أجل البساطة [43].

تحكم العملية

بمجرد تحديد المتطلبات المحددة للخلايا التي يتم توسيعها ، فإن معلمات العملية مثل درجة الحرارة وإجهاد القص والأكسجين المذاب (DO) وثاني أكسيد الكربون2 والمتغيرات البيئية مثل الأسمولية ودرجة الحموضة يجب أن تبقى عند القيم المثلى [14]. مطلوب مراقبة عملية مكثفة عبر الإنترنت والتحكم المتكامل للتكيف مع تغييرات العملية [45]. عادةً ما يتم الاحتفاظ بـ DO و pH للوسط ثابتًا لتوفير بيئة متسقة تدعم التوسع الأمثل للخلية. تُعد إشارات DO و pH ذات قيمة لتقييم حالة وسط التمدد وتكاثر الخلايا ، مما يؤدي إلى إستراتيجية تغذية متناسبة [41] ، على الرغم من أن هذا نهج محدود إلى حد ما. يتم تضمين بعض التقنيات التي يجب أخذها في الاعتبار لمراقبة عملية ACT ومراقبتها في الجدول 1. يجب أن يكون الهدف النهائي لرصد العملية هو العثور على واصفات يمكن أن تعطي معلومات حول تأثير التباين من دفعة إلى دفعة أو من مانح إلى مانح على عملية التوسع [58]. سيكون أفضل نهج لتطوير التحكم في العملية هو استخدام بيانات PAT لتسهيل القرارات المتعلقة بالعملية في الوقت الفعلي ، أو حتى بشكل تنبؤي. يمكن أن يشمل ذلك نقاط القرار للتنقل ، وبدء التروية ، ونقطة الحصاد ، أو حتى إطلاق مراقبة الجودة على أساس الحد الأدنى من الصلاحية أو مستوى الذيفان الداخلي. من الناحية المثالية ، سوف تتطور مثل هذه التقنيات لقياس تعبير العلامات السطحية للعلامات المظهرية الرئيسية.

معالجة إجهاد القص

يجب أن يتجنب التوسع خارج الجسم الحي لجميع أنواع الخلايا المناعية الإجهاد الميكانيكي عن طريق الديناميات المتوسطة الفوضوية وغير المتجانسة [19]. لقد ثبت منذ فترة طويلة أن الخلايا الحيوانية حساسة للقص ، والتي ، فوق مستويات معينة ، تعرض قابليتها للحياة للخطر. إلى جانب التأثير المباشر الذي يمكن أن تمارسه القوى الميكانيكية على سلامة غشاء الخلية ، تتكيف الخلايا الحيوانية مع بيئة كل نسيج ، وتطور آليات حساسة لاكتشاف تغيرات القص. لتطوير فهم مقبول لكيفية تأثير هذه القوى على سلوك الخلية ، من الضروري إعادة إنشاء مستوى قوى القص مماثل لما هو موجود في الجسم داخل مفاعل حيوي ، مما يسمح بالتوصيف المفصل والتحكم في عملية النقل الميكانيكي [59] والتأثيرات المباشرة من القص على الخلايا. الأهم من ذلك ، يجب تصميم التحريض ليس فقط لإدارة تعرض الخلايا للقص ، ولكن أيضًا كفاءة نقل الكتلة وتعليق الخلايا وتجنب التغايرات التي قد تسبب عدم تناسق الخلية [25].

أخذ العينات التمثيلي

يجب أن تظل عملية المفاعل الحيوي المصممة بعيدًا عن أي تأثيرات ضارة اصطناعية على سلامة الخلية عن طريق تمرير الخلايا وإعادة زرعها ، لأنها قد تقلل من إجمالي العائد [19]. يجب أيضًا تصميم أخذ العينات وحصاد الخلايا أو الوسيط أو كليهما مع مراعاة البساطة. أخذ العينات له عيوب معينة يجب تخفيفها [35]: للحصول على عينة تمثيلية للمفاعل الحيوي ، يجب سحب حجم كبير ، والذي يمكن أن يؤثر على المحصول ، خاصة إذا تم استخدام عدة أوعية صغيرة الحجم لتوسيع الخلية. يمكن أن يؤدي تكرار أخذ العينات أيضًا إلى زيادة خطر تلويث المفاعل الحيوي. تشمل المشكلات التي تحتاج إلى حل في مثل منصات تطوير عملية العلاج بالخلايا اتخاذ قرار بشأن كمية الخلايا اللازمة لتعكس عدم التجانس واستخدام تحليل الصور القائم على الخلية الحية واستراتيجيات "المختبر على الرقاقة" [43].

التحفيز والمكملات

عادة ما يتم إجراء تغييرات الوسائط في المفاعلات الحيوية عن طريق إضافة المغذيات ، أو عن طريق الاستبدال الكلي أو الجزئي للوسائط ، أو عن طريق التروية. إذا أنتجت مزرعة الخلية مستويات غير ضارة من منتجات النفايات ، فيمكن إضافة مستويات مركزة من العناصر الغذائية بمرور الوقت لتغذية الثقافة المتنامية. حتمًا ، تبدأ نواتج الأيض مثل اللاكتات والأمونيا في التراكم ، ويلزم استبدال الوسائط أو التروية. يعتبر الإرواء ، الذي يتم فيه تغذية الوسائط الجديدة تدريجيًا وإزالة الوسائط القديمة مع الاحتفاظ بالخلايا ، الطريقة المثالية للتدخل والحفاظ على بيئة مستقرة للعلاج بالخلايا [35]. وتجدر الإشارة أيضًا إلى أن استنفاد الخلايا يمكن أن يحدث بواسطة طرق التنشيط الحالية ، والتي تتطلب عمومًا أيضًا اهتمامًا دقيقًا من المشغل [32]. وبسبب ذلك ، هناك حاجة إلى تحسين دقيق لتغذية المغذيات ومنشطات الخلايا / المنبهات ، لتكون قادرة على توفيرها بدقة في وسط الزراعة ، مما يسمح بمختلف أنماط التغذية.

نقل الغاز

يحدث نقل الغاز بشكل سلبي في الأنظمة الساكنة ، مما يحد من توافر الأكسجين في الأوعية كبيرة الحجم ، حيث يتناسب التدفق المنتشر للغاز عكسًا مع سمك السائل الذي يجب اختراقه ، وفقًا لقانون Fick ونموذج McMurtrey لنشر الأكسجين [60]. قد يكون نقل الأكسجين محدودًا في المفاعلات الحيوية غير المروية لأن معدلات التحريض المنخفضة مطلوبة لتقليل إجهاد القص على الخلايا الليمفاوية ويفضل أيضًا تهوية فراغ الرأس بشكل عام لنفس الأسباب. هذا ، على المدى الطويل ، قد يعيق ناتج التوسع النهائي للنظام [41]. يمكن توفير الأكسجين لمفاعل حيوي إما عن طريق فراغ الرأس أو عن طريق رشاش يعمل على تشتيت الغاز في الوسط ، ومع ذلك ، فقد ثبت أن تجنيب الأوكسجين قد يكون ضارًا بنمو الخلايا المناعية [61]. عادة ما يكون تركيز الأكسجين الفسيولوجي أقل من الغلاف الجوي. وبسبب ذلك ، قد يؤدي إنشاء بروتوكولات زراعة تشبه ظروف الأوكسجين في الجسم الحي إلى تحسين إنتاجية التمدد ووظائف الخلية [22]. وبالمثل ، فإن استخدام ثاني أكسيد الكربون2 المستويات التي تمثل عتبة التقلب البيولوجي يمكن أن تكون مفيدة أيضًا لنتائج العملية. وتجدر الإشارة إلى أن انخفاض توتر الأكسجين يؤدي إلى تقليل تكاثر الخلايا التائية البشرية وزيادة الضرر التأكسدي داخل الخلايا والقابلية للاستماتة عند التنشيط ، مما يبرز أهمية التحكم في مستويات الأكسجين في المزرعة [62].

التطابق الفسيولوجي

لا يوجد مفاعل حيوي مثالي يناسب جميع الأغراض لجميع الخلايا ، ولكن يجب أن يكون قادرًا على تكرار العديد من الظروف التي يمر بها الجسم الحي في المختبر ، وبالتالي يجب أن يسمح بالاختبار التجريبي والتكييف الميكانيكي ومراقبة الخلايا الحية في الظروف الديناميكية. ]. في ذكرى فسيولوجية قريبة ، غالبًا ما تتطلب الخلايا المناعية المزروعة في المفاعلات الحيوية حواجز APCs للتحفيز ، والزراعة ثلاثية الأبعاد ، والتلامس الخلوي المتحكم فيه ، والبيئات الدقيقة المحلية غير المضطربة [25]. يجب أن تؤخذ هذه الاحتياجات في الاعتبار أثناء تصميم الأجهزة المناسبة ، بدءًا من حقيقة أن الخلايا المكونة للدم لا تتطلب سطحًا لتنمو ، فهي مستقلة عن الإرساء [63]. صحيح أنه يمكن تكييف الخلايا مع تصميم مفاعل حيوي محدد كبديل لهندسة المفاعل الحيوي نفسه ، ولكن يجب ملاحظة أن هذا النهج قد لا يكون متاحًا لمعظم العلاجات الخلوية ، حيث قد تصبح الخلايا شيخوخة بعد قدر معين من المضاعفات [25]. وتجدر الإشارة أيضًا إلى أن بعض الخلايا قد تحتاج إلى أن تكون على اتصال مكثف مع بعضها البعض ، مثل TILs [64] وخلايا T [65 ، 66] ، وبعضها يميل أيضًا إلى تكوين مجاميع يجب التحكم فيها لتحقيق النمو الأمثل [ 67] ، عادة عن طريق التعطيل الميكانيكي للعناقيد.

قد تفي تكوينات المفاعل المختلفة بهذه المتطلبات بدرجات متفاوتة. بالنظر إلى هذا الإطار ، في الفصل التالي نستكشف الخيارات المتاحة حاليًا ونسلط الضوء على الخصائص الأكثر صلة التي تبرز من المقارنة.


الخلايا القاتلة الطبيعية في الصحة والمرض

حتى الآن ، لا تزال الوظائف المتنوعة للخلايا القاتلة الطبيعية في مناعة الثدييات غير مفهومة تمامًا. ومع ذلك ، فإن البيانات المتراكمة التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من اضطرابات نادرة تتميز بنقص الخلايا القاتلة الطبيعية قد سلطت الضوء على صلتها بصحة الإنسان (187) وقد ولدت الدراسات التي تستخدم نماذج الفئران المعدلة وراثيًا أفكارًا مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بوظائفها المؤيدة للالتهابات والمناعة (188). ). تنتج الخلايا القاتلة الطبيعية وتستجيب للمنبهات الالتهابية وهي معروفة جدًا بأدوارها في المناعة المضادة للفيروسات والمراقبة المناعية للورم ، ومع ذلك ، تشارك الخلايا القاتلة الطبيعية أيضًا في مجموعة متنوعة من اضطرابات المناعة الذاتية كمحركات للالتهاب المرضي (189). تظهر الأدلة الناشئة أيضًا أن الخلايا القاتلة الطبيعية يمكنها تنظيم البرامج المضادة للالتهابات ، مثل إصلاح الأنسجة (190 ، 191). ما إذا كانت الخلايا القاتلة الطبيعية تعمل كمؤثرات فطرية أساسية أو خلايا ملحقة كجزء من الاستجابة المناعية التكيفية يبدو أنها تعتمد على السياق ، ولكن مساهمتها كمستجيبين للخط الأول ووسطاء التهابات أساسية راسخة. الأهم من ذلك ، كيف الحديث المتبادل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية (& # x003B1 & # x003B2-TCR & # 43 T ، & # x003B3 & # x003B4-TCR & # 43 T ، NKT ، والخلايا B) ، الخلايا النخاعية (الخلايا الوحيدة ، الضامة ، و DCs) ، أو الخلايا غير المناعية (الخلايا الظهارية أو البطانية) تعداد استجابة مناعية منتجة بعيدًا عن الفهم الكامل.

وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية أثناء العدوى الفيروسية والبكتيرية

الخلايا القاتلة الطبيعية ضرورية للدفاع ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض. تتعرف مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة وهي مكونات أساسية للاستجابة المناعية الفطرية بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية (192). يؤدي تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية من خلال PRRs إلى إنتاج TNF و IFN - & # x003B3 التي تساهم في الدفاع المضاد للبكتيريا (192 ، 193). تساهم الخلايا القاتلة الطبيعية أيضًا في المناعة المضادة للفطريات من خلال آليات مباشرة وغير مباشرة (194). أولاً ، يمكن أن تدمر الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل مباشر الأغشية الفطرية من خلال الإطلاق المستهدف للحبيبات السامة للخلايا التي تحتوي على البروتين الذي يعطل الغشاء ، perforin (195). يمكنهم أيضًا تسهيل استجابة المضيف المضاد للفطريات من خلال البلعمة المباشر بالإضافة إلى إنتاج وسطاء التهابي (196). على وجه التحديد ، يعد إنتاج GM-CSF بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية أمرًا بالغ الأهمية للتحكم C. البيض العدوى عن طريق تعزيز نشاط فطريات العدلات (197). ومع ذلك ، فإن أفضل وصف للمساهمة المباشرة لخلايا NK في المناعة الميكروبية فيما يتعلق بإجراءاتها المنفصلة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا.

طورت مسببات الأمراض داخل الخلايا مجموعة متنوعة من الآليات لتفادي الاستجابة المناعية للمضيف بما في ذلك تخريب نظام المراقبة المناعية معقد التوافق النسيجي الكبير (198). جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير متعددة الأشكال بشكل كبير داخل مجموعة سكانية ويتم ترميزها بواسطة مستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) الجينات في البشر و ، H-2 في الفئران (199). يمكن تقسيم جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير إلى فئتين رئيسيتين ، معقد التوافق النسيجي الكبير من الدرجة الأولى (MHC-I) ومعقد التوافق النسيجي الكبير من الدرجة الثانية (MHC-II). ترتبط جزيئات MHC-I ، وتقدم الببتيدات الداخلية للخلايا التائية السامة للخلايا CD8 & # 43 ، ويؤدي تخريب آلية المراقبة المناعية هذه إلى استجابة مناعية تكيفية غير كافية (200). يتم التعبير عن MHC-II بكثرة في خلايا تقديم المستضد (APCs) ويسهل عرض الببتيدات الخارجية على الخلايا التائية المساعدة CD4 & # 43 (201). تُظهر جميع الخلايا الجسدية تقريبًا ببتيدات داخلية المنشأ على سطحها في سياق MHC-I ، وهذا يسمح للجهاز المناعي بأخذ عينات من البيئة داخل الخلايا (201). يحدد مجمع الببتيد & # x02013MHC-I أيضًا العوامل المناعية & # x0201Cالذات& # x0201D حالة وصيانة هذا النظام ضروريان لكل من التحمل المناعي وكذلك رفض & # x0201Cغير الذاتية& # x0201D الخلايا والأنسجة التي تعبر عن أنماط فردانية مميزة MHC-I (202).

الشكل 8. آليات التعرف على الخلايا المستهدفة بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية (NK). تفتقر الخلايا القاتلة الطبيعية إلى مستقبلات النمط النسيجي وتعتمد على التنشيط المشفر بالخط الجرثومي والمستقبلات المثبطة للتعرف على الخلايا الأخرى من حولها. فيما يلي بعض الآليات الأساسية التي تدرك بها الخلايا القاتلة الطبيعية الخلايا المستهدفة. (أ) & # x0201Cالذات المناعية& # x0201D: التعرف على الفئة الأولى من معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC-I) (مستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA)) أو مستضد التوافق النسيجي -2 (H2 ، الماوس) عن طريق المستقبلات المثبطة [مستقبلات شبيهة بالجلوبيولين المناعي للخلية القاتلة (KIR) أو Ly49] تعرف الخلايا القاتلة الطبيعية أنها تتفاعل مع الخلايا الطبيعية وتحتوي على تنشيطها. (ب) & # x0201Cفقدان الذات& # x0201D: التعرف على الخلايا المستهدفة التي إما لا تعبر عن MHC-I أو تقللها إلى ما دون المستويات المثلى يمكن أن يؤدي إلى تنشيط خلية NK. (ج) & # x0201Cمحرض الذات& # x0201D: التعرف على الروابط النشطة التي يتم التعبير عنها على الخلايا المستهدفة بواسطة المستقبلات المشفرة بالخط الجرثومي مثل NKG2D (H60 ، الماوس MIC-A / B ، الإنسان) ، Ly49H (الفئران المشتقة من الفيروس المضخم للخلايا m157 ، الماوس) ، NCR1 (a عدد البروتينات الفيروسية) يمكنه التغلب على الإشارات المثبطة بوساطة MHC-I مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية. (د) & # x0201Cغير الذاتية& # x0201D: التعرف على الأنسجة المزروعة بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية ، حيث تعبر أنسجة المتبرع إما عن MHC-I خيفي أو أحادي التطابق.

تمتلك الخلايا القاتلة الطبيعية آليات فريدة لاحتواء مسببات الأمراض داخل الخلايا بما في ذلك الفيروسات وبعض أنواع البكتيريا عن طريق تحلل الخلايا المصابة وإطلاقها وتعريضها لمناعة خلوية تكيفية (203 ، 204). تنتج الخلايا القاتلة الطبيعية أيضًا السيتوكينات الالتهابية ، مثل IFN - & # x003B3 لاحتواء النمو الفيروسي أو البكتيري (205 & # x02013207). على سبيل المثال ، يعمل Hemagglutinin ، وهو مستقبل حمض السياليك الذي يعبر عنه فيروس الأنفلونزا ، بمثابة رابط منشط لـ NCR1 (208 ، 209). يتم التعرف على البروتين السكري الغشائي المشفر بالفيروس المضخم للخلايا (MCMV) ، m157 ، بواسطة مستقبل Ly49H المعبر عنه في خلايا NK المشتقة من C57BL / 6 (210). خلايا NK من خلفيات فئران أخرى ، مثل 129 / SvJ و BALB / c ، لا تعبر عن Ly49H ، أو عامل مقاومة آخر ، مما يجعلها عرضة لـ MCMV لأنها غير قادرة على تكوين استجابة مناعية محددة بوساطة خلية NK للفيروس (211 & # x02013213). شارك NKG2D أيضًا في المناعة المضادة للفيروسات التي تتوسطها الخلايا القاتلة الطبيعية كما يتضح من الملاحظات المتعددة التي تقوم فيها بروتينات الفيروس المضخم للخلايا البشرية والفأرية بتنظيم روابط الإجهاد الخلوي التي تنشط الخلايا القاتلة الطبيعية من خلال هذا المستقبل (214 & # x02013217).

تتمتع الخلايا القاتلة الطبيعية بقدرة فريدة على تحديد الخلايا المصابة دون الارتباط المباشر بمركب MHC-I (12 ، 218). لذلك ، تظل مسببات الأمراض داخل الخلايا التي تتهرب من خلايا CD8 & # 43 T من خلال التدخل في التعبير السطحي لـ MHC-I عرضة لمناعة الخلايا القاتلة الطبيعية (219). من حيث المناعة المضادة للفيروسات ، لطالما اعتبرت الخلايا القاتلة الطبيعية وخلايا CD8 & # 43 T تمثل الذراعين الفطريين والتكيفين للاستجابة المناعية ، على التوالي (220). ومع ذلك ، فقد أعيد النظر مؤخرًا في فصل هذه الخلايا فيما يتعلق بمساهماتها في المناعة التكيفية بسبب اكتشاف الخلايا القاتلة الطبيعية التي تظهر ذاكرة مناعية (160 ، 221). على الرغم من أنها لا تستخدم مستقبلات النمط النسبي ، مثل TCR ، فقد تم وصف مجموعة صغيرة نسبيًا من خلايا الذاكرة NK بأنها مؤثرات طويلة العمر قادرة على استجابات الاسترجاع السريع (222).

تم التحقيق على نطاق واسع في تكوين خلايا الذاكرة NK في الفئران المصابة بـ MCMV وكانت الدراسات التي تستخدم هذا النظام حاسمة في تحديد الجزيئات التي تتوسط هذه الظاهرة (222 & # x02013225). أظهرت دراسة التطعيم باستخدام مستضدات من الفيروسات بما في ذلك الأنفلونزا وفيروس التهاب الفم الحويصلي وفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 أيضًا استجابات الخلايا القاتلة الطبيعية الشبيهة بالذاكرة في الفئران (226) وأظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية حماية معززة ضد العدوى الثانوية بفيروس اللقاح وفيروس الهربس البسيط النوع 2 (227 ، 228). بشكل جماعي ، تقدم هذه الدراسات أدلة دامغة تثبت الأهمية الوظيفية لذاكرة الخلايا القاتلة الطبيعية كآلية مناعية عالمية مضادة للفيروسات. Observations in humans have also suggested the ability of human NK cells to form memory (229, 230) however, the full contribution of memory NK cells to anti-viral immunity and potential implications this may have on vaccine development has yet to be determined.

Natural killer cells also recognize bacteria and bacterial products either directly or from infected cells and professional APCs (Figure 9) (231). Recent work has shown that NK cells can directly release granzymes proteases to initiate disruption of electron transport, generate superoxide anion, and inactivate bacterial oxidative defenses causing the death of Listeria monocytogenes, Escherichia coli، و Mycobacteria tuberculosis (232�). In addition, NK cells using Granzyme B mediated the killing of facultative anaerobic bacteria such as L. monocytogenes by cleaving essential proteins that are required for protein translation (aminoacyl tRNA synthetases and ribosomal proteins), folding (protein chaperones), and protein degradation (Clp system) (235). Indirect killing and containment of L. monocytogenes (236, 237), المكورات العنقودية الذهبية (238), Lactobacillus johnsonii (239), السل الفطري (240), and Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin (241) by NK cells have been described. Mechanisms by which NK cells mediate indirect clearance of bacteria are complex. Substantial evidence suggests that interleukins including IL-12 and IL-18 from monocytes and DCs play a central role (242�). Role of other inflammatory cytokines such as IL-27 and its cooperation with IL-18, IL-6, and IL-12 during the clearance of bacterial infections have been identified however, the precise mechanisms by which NK cells evoke the anti-microbial responses are yet to be elucidated (245, 246).

الشكل 9. Natural killer (NK) cells in health and disease. As the largest lymphocyte population representing innate immunity, NK cells perform diverse functions. Through their ability to mediate killing and to produce soluble factors, NK cells perform multitudes of immunological functions. Counter-clockwise: bidirectional interactions between NK cell and dendritic cells (DCs)/macrophages result in priming. Activated DCs and macrophages generate interleukin (IL)-15, IL-12, IL-18, IL-35, IFN-α, IFN-β, IL-27, IL-1β, and IL-23. These, in turn, activate NK cells to be primed, proliferate, and to produce inflammatory factors and chemokines such as interferon-gamma (IFN-γ), granulocyte/monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor (TNF)-α, CCL3, CCL4, and CCL5. In addition, IFN-γ from NK cells can increase the MHC class I expression and the transcription of genes encoding immuno-proteasomal subunits in these professional antigen-presenting cells and thereby augmenting T cell priming and activation. Similarly, virus-infected cells produce IFN-α, IFN-β, and IL-1β and present either “stress-induced” self-ligands or viral proteins on the cell surface that activate NK cells. A reduction in graft-versus-host disease (GvHD) is mediated through the production of IL-10 by the CD56 bright CD16 Neg NK cell subset and augmentation of GvT is potentiated عبر direct tumor killing by CD56 dim CD16 Pos NK cell subset. In addition, production of IL-22 by NK subsets may help the regeneration of epithelial cells in the mucosal tissues. Irrespective of these observations, the mechanisms by which NK cells are activated to respond during active GvHD/GvT is not fully understood. Genetic manipulation of NK cells has helped to improve the effector functionality and the longevity of human NK cells في الجسم الحي. Stable integration of gene encoding IL-15 into the genome of NK cells promotes sustained proliferation عبر an artificial autocrine loop. Similarly, integration of gene encoding IL-12 makes this cytokine abundantly available within the microenvironmental milieu and thereby augment the effector functions of NK cells, specifically, the production of IFN-γ. Augmented expression of NK cell activation receptors (NKRs) including NKG2D and NCR1 by genetic engineering increases the anti-tumor cytotoxicity of NK cells. Other studies have shown the expression of single chain variable fragment that forms the core ectodomain of chimeric antigen receptor (CAR) to augments the tumor-targeted killing of NK cells. These genetically modified NK cells provide exciting newer opportunities for cell-based therapies. The bidirectional interaction between NK and T cells results in the regulation of adaptive immunity. IL-2 produced by CD4 + Th1 cells play a vital role in the proliferation and expansion of NK cells. بالرغم ان في المختبر experiments consistently have provided support toward this notion, the في الجسم الحي evidence is far from convincing. However, the inflammatory factors produced by NK cells have a significant impact on both CD8 + and CD4 + T cells. Expression of “الذات” ligands for NKG2D by T cells results in the recognition and killing of T cells by NK cells during GvHD and anti-viral responses. In addition, a cleaved soluble form of these ligands (MIC-A/B) is present in the serum of cancer patients. This, in turn, plays an important role in containing the effector functions of T cells عبر direct binding to the NKG2D receptor expressed on T cells. NK cells recognize bacteria-infected cells (such as epithelial cells) either using toll-like receptors (TLR) or by activated through soluble factors including aryl hydrocarbon receptor (Ahr). This results in the production of IFN-γ and IL-22 that helps with the reduction in bacterial load and regeneration of epithelial cells, respectively. NK cells can also directly mediate the lysis of bacteria using granzymes and perforin.

Anti-Tumor Functions and the Clinical Utilization of NK Cells

The vital role of NK cells in tumor immunosurveillance was recognized soon after their initial characterization (247, 248). NK cells can detect changes in surface expression of self-MHC-I molecules on autologous cells which distinctively qualifies them to detect cells that have undergone malignant transformation (Figure 8) (218, 248). Genomic mutations that arise during the transformation process are reflected by a variety of phenotypic changes which alter the expression of cell surface molecules, including downregulation of the inhibitory “الذات” MHC-I (200, 249). The activity of NK cells against this “missing-self” condition has been well described (250, 251) and serves as a critical mechanism through which NK cells facilitate anti-tumor immunity. Transformed cells also express increased numbers of stress-induced molecules on their surface which can be recognized by specific NK cell receptors, such as NKG2D (120, 252). This concept, known as “induced self” (Figure 8) recognition (253, 254), explains why NK cell does not kill normal cells, such as erythrocytes, that do not express MHC-I on their surface but retain cytotoxic activity against MHC-I sufficient tumors (255). Elicitation of NK cell function is determined by the relative strength of activating and inhibitory receptor signaling and this concept, known as “altered balance,” ultimately controls NK cell activity under normal and disease conditions (256).

Decades of research in rodents have demonstrated the importance of NK cells in tumor clearance (14, 117, 247, 248). In humans, an 11-year follow-up study showed that low NK cell cytotoxic activity was correlated to an increased risk of cancer (257) and the presence of tumor-infiltrating NK cells is a positive prognostic marker for multiple malignancies including colorectal carcinoma (258), gastric carcinoma (259), and squamous cell lung cancer (260). Results from multiple studies demonstrate that NK cells have promise as a cancer immunotherapeutic for the treatment of hematological malignancies including acute myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia (261�). Allogenic NK cell therapy has proven effective in the clinic and, unlike T cell-based interventions, NK cell transfusion carries a relatively low risk of adverse off-tumor effects such as graft-versus-host disease (GvHD) (264).

Autologous NK cells may be inhibited by “الذات” MHC-I, thus limiting GvT effects in the absence of exogenous cytokines or antibodies (265, 266). Therefore, allogeneic NK cells along with hematopoietic stem cell transplant has been explored as a potential treatment for patients with high-risk solid tumors (263, 267, 268). Using non-myeloablative conditioning regimens to provide potent immune suppression without toxicity, the burden of cure then relies on the ability of transplanted donor cells to provide a GvT effect. Precedence in using low-intensity conditioning before transplanting allogeneic stem cells has been reported in Ewing sarcoma (269�), osteosarcoma (272, 273), germ cell tumors (274), rhabdomyosarcoma (275�), neuroblastoma (278�), Wilms tumor (281), and CNS tumors (282), suggesting that alloreactive donor NK cells infiltrate heterogeneous solid tumors and cross the blood𠄻rain barrier. A sizeable reduction in tumor burden has been observed (269). Using HLA-haploidentical family donors (parents and siblings), matched by only one HLA haplotype to the patient, have not only shown favorable outcomes in patients with solid tumors (263, 267, 283) but are also readily available and highly motivated donor sources. Thus, using HLA-haploidentical donors to augment GvT may be an effective strategy in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HCT) for treatment of solid tumors (263, 284).

Regulatory Functions of NK Cells

Most functions of NK cells are analogous to either CD8 + T or Th1 cells, including the production of pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF-α, and GM-CSF) and mediating cytotoxicity against infected or tumor cells (95). However, in addition to these, recent reports suggest NK cells also play regulatory functions (285, 286). NK cells mediate regulatory functions of other cell types including myeloid [DC (246, 287�), monocytes (291�), and macrophages (246, 294�)] or lymphoid [T (297, 298) and B (299�) cells] عبر cytokines production or through direct cell�ll contact in a receptor–ligand interaction-dependent manner. As part of the innate immune responses, effector functions of NK cells during the early phase is expected to dictate the threshold, direction, and the outcome of an immune response. These NK cell-mediated regulatory functions are predicted to occur during viral, bacterial, or protozoan infections, anti-tumor immune responses, unexpected immuno-pathological outcomes such as GvHD, and autoimmune diseases (302). Few of the examples are described below. A unique innate immunoregulatory function for the smaller CD56 bright subset of human NK cells (CD56 bright CD16 dim NKG2A + KIR − ) was proposed due to their inherent ability to produce significant amounts of IL-10, and IL-13 along with IFN-γ, TNF-α, and GM-CSF compared to that of the more substantial CD56 dim CD16 + subset (58). An Il-27-stimulated CD56 bright CD16 dim NKG2A + KIR − subset was able to suppress the proliferation of autologous CD4 + T cells in patients with multiple sclerosis through a cytotoxic mechanism involving perforin (303) or by the release of Granzymes (304, 305). Importantly, CD56 bright CD16 dim NKG2A + KIR − subset through their ability to produce adenosine and by the restricted expression of the ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (CD203a/PC-1) and the nucleotide-metabolizing ectoenzyme CD38 (an NAD + nucleosidase) was able to inhibit the proliferation of autologous CD4 + T cells (306).

Regulatory role of NK cells during GvHD is highly controversial (307). GvHD is one of the major complications and limiting factor in allogeneic HCT (308). Studies in both mouse and human lead to either suppressing or promoting rejection of HCT by NK cells. Furthermore, persistence or expansion of NK cells following HCT resulted in rejection and severe GvHD (309) while allograft-derived donor NK cells helped the engraftment of HCT by suppressing GvHD (310�). Mechanistically, NK cells can help to contain GvHD through distinct mechanisms including the killing of professional APCs and thereby controlling the proliferation and expansion of graft-specific T cell (314, 315). In addition, NK cells were able to directly lyse graft-specific T cells following the expression of activating ligands of NKG2D on these T cell (316, 317). Expression of both mouse (316, 318) (H60a, H60b, H60c, Rae-1, and Mult-1) and human (319�) (MIC-A, MIC-B, and ULBPs) activating ligands of NKG2D on stimulated T cells has been reported in a number of models. Also, shedding of these murine and human activating ligands has been demonstrated to employ a critical negative regulatory function on both T (322�) and NK (325, 326) cells. These findings provide an exciting new avenue in understanding an inherent regulatory interaction between NK cell and APCs or T cells and thereby potential clinical utilization. Irrespective of the recent advances, the precise functions and associated mechanisms by which NK cells contribute to an immune-suppressive or immune-sufficient tumor microenvironment is far from fully defined. Similarly, the complex interplay of cytokines and ILs that are derived from and regulating the functions of NK and professional APCs during viral or bacterial infections is yet to be fully appreciated. Furthermore, defining the interactions between conventional NK cells (ILC1) and ILC2 or ILC3 can help to formulate better immunotherapeutic approaches to infections associated with mucosal tissues.

NK Cells and CAR Therapy

Recent efforts to improve the clinical efficacy of NK cell immunotherapy has led to the development of genetically engineered NK cells that express a chimeric antigen receptor (CAR). Primary NK cells and NK cell lines can be engineered to express CARs which redirect the anti-tumor specificity of NK cells on an antigen-dependent basis (327). Through the manipulation of signaling motifs critical for lymphocyte activation, CARs are also designed to utilize specific intracellular signaling molecules which can further refine NK cell function and optimize their therapeutic potential (328, 329). Interestingly, the use of a clonal cell line derived from a human NK cell leukemia, known as NK-92, has been genetically modified to express fully functional CARs and these cells have shown great promise with regards to their safety and efficacy in recent clinical trials (327, 330, 331). Moreover, the use of irradiated cell lines may provide a fast and affordable off-the-shelf option for a personalized cellular immunotherapy treatment (332, 333) and are quickly rising to the forefront of cell-based cancer immunotherapies (Figure 9).


Future perspectives and outstanding questions

Collectively, TLS and the associated T and B lymphocytes might serve as biomarkers useful to select patients who might better respond to immunotherapy. However, there are still many questions that remain to be answered before they can be incorporated into clinical practice as prognostic tools. 155

Do immature and mature TLS differentially impact a patient’s prognosis?

It is still unclear whether the degree of TLS maturation impacts a patient’s prognosis or treatment efficacy. Indeed, whether immature and disorganized TLS with sparse cellular aggregates and no evidence of effective conventional adaptive immunity convey similar prognostic value as mature and structurally well-defined TLS harboring follicles and germinal centers remains unclear. Recently, Li and colleagues (2020) endeavored to examine this issue in oral squamous cell carcinoma. They found that the presence of TLS was associated with increased 5 years overall- and relapse-free survival, and importantly, both immature and mature TLS conveyed equally positive outcomes. 58 In contrast, Posch وآخرون. (2018) delineated that TLS in colorectal tumors exhibited different degrees of maturation which were associated with differential prognostic values. 47 In particular, mature TLS containing germinal centers had a more positive prognostic outcome compared with immature TLS. 47 Thus, evaluation of TLS maturation status in every tumor type would bring TLS into focus as an accurate prognostic tool for cancer treatment.

Can patient survival and response to treatment be predicted based on prospective evaluation of TLS ?

In most cases, the presence of TLS in tumors and their correlation with patient outcomes have been evaluated retrospectively. Given the consistent positive correlation of TLS with the anti-tumor immune response, prognosis and immunotherapeutic responses, prospective studies are warranted to determine the utility of measuring TLS presence, composition and density as prognostic tools or predictive markers of therapy efficacy.

Does TLS composition differently impact patient prognosis?

While the presence of TLS often positively impacts clinical outcomes, TLS composition itself might dictate treatment efficacy, tumor recurrence and patient survival. Indeed, Yamaguchi and colleagues 156 classified TLS into five categories based on their immune cell composition and found that TLS enriched in helper T cells were associated with disease relapse in advanced colorectal cancer. Another example is the diversity found among ASC where IgA producing cells are almost exclusively associated with a poor prognosis, while IgG + secreting cells frequently correlated with increased patient survival. Thus, better understanding of the composition of the immune infiltrate and function of TLS-forming cells, such as the isotype of ASC may be important.

Therapeutic intervention – can we specifically induce or enhance TLS formation in tumors?

Strategies augmenting من جديد TLS formation in patient tumors could potentiate antitumor treatments leading to an increase in therapy response rates and patient progression- and overall-survival. While a number of preclinical studies have demonstrated the potential value of such treatments, additional studies and clinical trials are necessary to determine the therapeutic value conveyed by combining TLS- or B lymphocyte-specific targeting with current immunotherapeutic treatments.

The development of new technologies that enable the interrogation of more than 50 cellular markers simultaneously allows the precise characterization of the cellular composition, function and localization within tumors. 157� Similar approaches could be used to investigate in detail TLS composition and function. Recently, Schurch and colleagues 160 elegantly identified nine conserved distinct components characteristic of colorectal cancer immune microenvironment – described as �llular neighbourhoods’ – which differentially impact a patient’s survival. The expansion of our capabilities to study a large number of parameters simultaneously might increase our understanding of the tumor microenvironment. This is likely to shed light on the cellular and molecular events associated with TLS formation and intratumoral T and B lymphocytes function associated with successful anti-tumor immunity and therapy responses.


محتويات

In 1982, Nobel laureate James P. Allison first discovered the T-cell receptor. [6] Then, Tak Wah Mak [7] and Mark M. Davis [8] identified the cDNA clones encoding the human and mouse TCR respectively in 1984. These findings allowed the entity and structure of the elusive TCR, known before as the "Holy Grail of Immunology", to be revealed. This allowed scientists from around the world to carry out studies on the TCR, leading to important studies in the fields of CAR-T, cancer immunotherapy and checkpoint inhibition.

The TCR is a disulfide-linked membrane-anchored heterodimeric protein normally consisting of the highly variable alpha (α) and beta (β) chains expressed as part of a complex with the invariant CD3 chain molecules. T cells expressing this receptor are referred to as α:β (or αβ) T cells, though a minority of T cells express an alternate receptor, formed by variable gamma (γ) and delta (δ) chains, referred as γδ T cells. [9]

Each chain is composed of two extracellular domains: Variable (V) region and a Constant (C) region, both of Immunoglobulin superfamily (IgSF) domain forming antiparallel β-sheets. The Constant region is proximal to the cell membrane, followed by a transmembrane region and a short cytoplasmic tail, while the Variable region binds to the peptide/MHC complex.

The variable domain of both the TCR α-chain and β-chain each have three hypervariable or complementarity-determining regions (CDRs). There is also an additional area of hypervariability on the β-chain (HV4) that does not normally contact antigen and, therefore, is not considered a CDR. [ بحاجة لمصدر ]

The residues in these variable domains are located in two regions of the TCR, at the interface of the α- and β-chains and in the β-chain framework region that is thought to be in proximity to the CD3 signal-transduction complex. [10] CDR3 is the main CDR responsible for recognizing processed antigen, although CDR1 of the alpha chain has also been shown to interact with the N-terminal part of the antigenic peptide, whereas CDR1 of the β-chain interacts with the C-terminal part of the peptide.

CDR2 is thought to recognize the MHC. CDR4 of the β-chain is not thought to participate in antigen recognition, but has been shown to interact with superantigens.

The constant domain of the TCR consists of short connecting sequences in which a cysteine residue forms disulfide bonds, which form a link between the two chains.

The TCR is a member of the immunoglobulin superfamily, a large group of proteins involved in binding, recognition, and adhesion the family is named after antibodies (also called immunoglobulins). The TCR is similar to a half-antibody consisting of a single heavy and single light chain, except the heavy chain is without its crystallisable fraction (Fc). The two subunits of TCR are twisted together. Whereas the antibody uses its Fc region to bind to Fc Receptors on leukocytes, TCR is already docked onto the cell membrane. However, it is not able to mediate signal transduction itself due to its short cytoplasmic tail, so TCR still requires CD3 and zeta to carry out the signal transduction in its place [ بحاجة لمصدر ] , just as antibodies require binding to FcRs to initiate signal transduction. In this way the MHC-TCR-CD3 interaction for T cells is functionally similar to the antigen(Ag)-immunoglobulin(Ig)-FcR interaction for myeloid leukocytes, and Ag-Ig-CD79 interaction for B cells.

The generation of TCR diversity is similar to that for antibodies and B-cell antigen receptors. It arises mainly from genetic recombination of the DNA-encoded segments in individual somatic T cells by somatic V(D)J recombination using RAG1 and RAG2 recombinases. Unlike immunoglobulins, however, TCR genes do not undergo somatic hypermutation, and T cells do not express activation-induced cytidine deaminase(AID). The recombination process that creates diversity in BCR (antibodies) and TCR is unique to lymphocytes (T and B cells) during the early stages of their development in primary lymphoid organs (thymus for T cells, bone marrow for B cells).

Each recombined TCR possess unique antigen specificity, determined by the structure of the antigen-binding site formed by the α and β chains in case of αβ T cells or γ and δ chains on case of γδ T cells. [11]

  • The TCR alpha chain is generated by VJ recombination, whereas the beta chain is generated by VDJ recombination (both involving a random joining of gene segments to generate the complete TCR chain).
  • Likewise, generation of the TCR gamma chain involves VJ recombination, whereas generation of the TCR delta chain occurs by VDJ recombination.

The intersection of these specific regions (V and J for the alpha or gamma chain V, D, and J for the beta or delta chain) corresponds to the CDR3 region that is important for peptide/MHC recognition (see above).

It is the unique combination of the segments at this region, along with palindromic and random nucleotide additions (respectively termed "P-" and "N-"), which accounts for the even greater diversity of T-cell receptor specificity for processed antigenic peptides.

Later during development, individual CDR loops of TCR can be re-edited in the periphery outside thymus by reactivation of recombinases using a process termed TCR revision (editing) and change its antigenic specificity.

In the plasma membrane the TCR receptor chains α and β associate with six additional adaptor proteins to form an octameric complex. The complex contains both α and β chains, forming the ligand-binding site, and the signaling modules CD3δ, CD3γ, CD3ε and CD3ζ in the stoichiometry TCR α β - CD3εγ - CD3εδ - CD3ζζ. Charged residues in the transmembrane domain of each subunit form polar interactions allowing a correct and stable assembly of the complex. [12] The cytoplasmic tail of the TCR is extremely short, hence the CD3 adaptor proteins contain the signalling motifs needed for propagating the signal from the triggered TCR into the cell. The signalling motifs involved in TCR signalling are tyrosine residues in the cytoplasmic tail of these adaptor proteins that can be phosphorylated in the event of TCR-pMHC binding. The tyrosine residues reside in a specific amino acid sequence of the signature Yxx(L/I)x6-8Yxx(L/I), where Y, L, I indicate tyrosine, leucine and isoleucine residues, x denotes any amino acids, the subscript 6-8 indicates a sequence of 6 to 8 amino acids in length. This motif is very common in activator receptors of the non-catalytic tyrosine-phosphorylated receptor (NTR) family and is referred to as immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). [5] CD3δ, CD3γ and CD3ε each contain a single ITAM, while CD3ζ contains three ITAMs. In total the TCR complex contains 10 ITAMs. [12] Phosphorylated ITAMs act as binding site for SH2-domains of additionally recruited proteins.

Each T cell expresses clonal TCRs which recognize a specific peptide loaded on a MHC molecule (pMHC), either on MHC class II on the surface of antigen-presenting cells or MHC class I on any other cell type. [13] A unique feature of T cells is their ability to discriminate between peptides derived from healthy, endogenous cells and peptides from foreign or abnormal (e.g. infected or cancerous) cells in the body. [14] Antigen presenting cells do not discriminate between self and foreign peptides and typically express a large number of self derived pMHC on their cell surface and only a few copies of any foreign pMHC. For example, it has been shown that cells infected with HIV have only 8-46 HIV specific pMHCs next to 100000 total pMHC per cell. [15] [16]

Because T cells undergo positive selection in the thymus there is a non-negligible affinity between self pMHC and the TCR, nevertheless, the T-cell receptor signalling should not be activated by self pMHC such that endogenous, healthy cells are ignored by T cells. However, when these very same cells contain even minute quantities of pathogen derived pMHC, T cells must get activated and initiate immune responses. The ability of T cells to ignore healthy cells but respond when these same cells express a small number of foreign pMHC is known as antigen discrimination. [17] [18]

To do so, T cells have a very high degree of antigen specificity, despite the fact that the affinity to the peptide/MHC ligand is rather low in comparison to other receptor types. [19] The affinity, given as the dissociation constant (كد), between a TCR and a pMHC was determined by surface plasmon resonance (SPR) to be in the range of 1-100 μM, with an association rate (كتشغيل) of 1000 -10000 M −1 s −1 and a dissociation rate (كإيقاف) of 0.01 -0.1 s −1 . [20] In comparison, cytokines have an affinity of KD = 10-600 pM to their receptor. [21] It has been shown that even a single amino acid change in the presented peptide that affects the affinity of the pMHC to the TCR reduces the T cell response and cannot be compensated by a higher pMHC concentration. [22] A negative correlation between the dissociation rate of the pMHC-TCR complex and the strength of the T cell response has been observed. [23] That means, pMHC that bind the TCR for a longer time initiate a stronger activation of the T cell. Furthermore, T cells are very sensitive. Interaction with a single pMHC is enough to trigger activation. [24] Also, the decision whether a T cell response to an antigen is made quickly. T cells rapidly scan pMHC on an antigen presenting cell to increase the chance of finding a specific pMHC. On average, T cell encounter 20 APCs per hour. [25]

Different models for the molecular mechanisms that underlie this highly specific and highly sensitive process of antigen discrimination have been proposed. The occupational model simply suggests that the TCR response is proportional to the number of pMHC bound to the receptor. Given this model, a shorter lifetime of a peptide can be compensated by higher concentration such that the maximum response of the T cell stays the same. However, this cannot be seen in experiments and the model has been widely rejected. [23] The most accepted view is that the TCR engages in kinetic proofreading. The kinetic proofreading model proposes that a signal is not directly produced upon binding but a series of intermediate steps insure a time delay between binding and signal output. Such intermediate "proofreading" steps can be multiple rounds of tyrosine phosphorylation. These steps require energy and therefore do not happen spontaneously, only when the receptor is bound to its ligand. This way only ligands with high affinity that bind the TCR for a long enough time can initiate a signal. All intermediate steps are reversible, such that upon ligand dissociation the receptor reverts to its original unphosphorylated state before a new ligand binds. [26] This model predicts that maximum response of T cells decreases for pMHC with shorter lifetime. Experiments have confirmed this model. [23] However, the basic kinetic proofreading model has a trade-off between sensitivity and specificity. Increasing the number of proofreading steps increases the specificity but lowers the sensitivity of the receptor. The model is therefore not sufficient to explain the high sensitivity and specificity of TCRs that have been observed. (Altan Bonnet2005) Multiple models that extend the kinetic proofreading model have been proposed, but evidence for the models is still controversial. [14] [27] [28]

The antigen sensitivity is higher in antigen-experienced T cells than in naive T cells. Naive T cells pass through the process of functional avidity maturation with no change in affinity. It is based on the fact that effector and memory (antigen-experienced) T cell are less dependent on costimulatory signals and higher antigen concentration than naive T cell. [29]

The essential function of the TCR complex is to identify specific bound antigen derived from a potentially harmful pathogen and elicit a distinct and critical response. At the same time it has to ignore any self-antigen and tolerate harmless antigens such as food antigens. The signal transduction mechanism by which a T cell elicits this response upon contact with its unique antigen is termed T-cell activation. Upon binding to pMHC, the TCR initiates a signalling cascade, involving transcription factor activation and cytoskeletal remodelling resulting in T cell activation. Active T cells secrete cytokines, undergo rapid proliferation, have cytotoxic activity and differentiate into effector and memory cells. When the TCR is triggered, T cells form an immunological synapse allowing them to stay in contact with the antigen presenting cell for several hours. [30] On a population level, T cell activation depends on the strength of TCR stimulation, the dose–response curve of ligand to cytokine production is sigmoidal. However, T cell activation on a single cell level can be characterised by a digital switch-like response, meaning the T cell is fully activated if the stimulus is higher than a given threshold, otherwise the T cell stay in its non-activated state. There is no intermediate activation state. The robust sigmoid dose-response curve on population level results from individual T cells having slightly different thresholds. [22]

T cells need three signals to become fully activated. Signal 1 is provided by the T-cell receptor when recognising a specific antigen on a MHC molecule. Signal 2 comes from co-stimulatory receptors such as CD28, presented on the surface of other immune cells. It is expressed only when an infection was detected by the innate immune system, it is a "Danger indicating signal". This two-signal system makes sure that T cells only respond to harmful pathogens and not to self-antigens. An additional third signal is provided by cytokines, which regulate the differentiation of T cells into different subsets of effector T cells. [30] There are myriad molecules involved in the complex biochemical process (called trans-membrane signaling) by which T-cell activation occurs. Below, the signalling cascade is described in detail.

Receptor activation Edit

The initial triggering follows the mechanism common for all NTR receptor family members. Once the TCR binds a specific pMHC, the tyrosine residues of the Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) in its CD3 adaptor proteins are phosphorylated. The residues serve as docking sites for downstream signalling molecules, which can propagate the signal. [31] [32] Phosphorylation of ITAMs is mediated by the Src kinase Lck. Lck is anchored to the plasma membrane by associating with the co-receptor CD4 or CD8, depending on the T cell subtype. CD4 is expressed on helper T cells and regulatory T cells, and is specific for MHC class II. CD8, on the other hand, specific for MHC class I, is expressed on cytotoxic T cells. Binding of the co-receptor to the MHC bring Lck in close proximity to the CD3 ITAMs. It has been shown that 40% of Lck is active even before the TCR binds pMHC and therefore has the ability to constantly phosphorylate the TCR. [33] Tonic TCR signalling is avoided by the presence of phosphatase CD45 that removes phosphorylation from tyrosine residues and inhibits signal initiation. Upon binding the balance of kinase activity to phosphatase activity is perturbed, leading to a surplus of phosphorylation and initiation of the signal. How such perturbation is accomplished by TCR binding is still debated. Mechanisms involving conformational change of TCR, TCR aggregation and kinetic segregation have been suggested. [31] Tyrosine kinase Fyn might be involved in ITAM phosphorylation but is not essential for TCR signalling. [34] [35]

Proximal TCR signaling Edit

Phosphorylated ITAMs in the cytoplasmic tails of CD3 recruit protein tyrosine kinase Zap70 that can bind to the phosphorylated tyrosine residues with its SH2 domain. This brings Zap70 into close proximity to Lck which results to its phosphorylation and activation by Lck. [36] Lck phosphorylates a number of different proteins in the TCR pathway. [37] Once activated, Zap70 is able to phosphorylate multiple tyrosine residues of the transmembrane protein LAT. LAT is a scaffold protein associated with the membrane. It itself does not have any catalytic activity but it provides binding sites for signalling molecules via phosphorylated tyrosine residues. LAT associates with another scaffolding protein Slp-76 via the Grap2 adaptor protein, which provides additional binding sites. Together LAT and Slp-76 provide a platform for the recruitment of many downstream signalling molecules. By bringing these signalling molecules into close proximity, they can then be activated by Lck, Zap70 and others kinases. Therefore, the LAT/Slp76 complex act as a highly cooperative signalosome. [36]

Molecules that bind the LAT/Slp76 complex include: Phospholipase Cγ1 (PLCγ1), SOS via a Grb2 adaptor, Itk, Vav, Nck1 and Fyb. [36]

Signal transduction to the nucleus Edit

PLCγ is a very important enzyme in the pathway as it generates second messenger molecules. It is activated by the tyrosine kinase Itk which is recruited to the cell membrane by binding to Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3). PIP3 is produced by the action of Phosphoinositide 3-kinase(PI-3K), which phosphorylates Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) to produce PIP3. It is not known that PI-3K is activated by the T cell receptor itself, but there is evidence that CD28, a co-stimulatory receptor providing the second signal, is able to activate PI-3K. The interaction between PLCγ, Itk and PI-3K could be the point in the pathway where the first and the second signal are integrated. Only if both signals are present, PLCγ is activated. [30] Once PLCγ is activated by phosphorylation, it hydrolyses PIP2 into two secondary messenger molecules, namely the membrane-bound diacyl glycerol(DAG) and the soluble inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). [38]

These second messenger molecules amplify the TCR signal and distribute the prior localised activation to the entire cell and activate protein cascades that finally lead to the activation of transcription factors. Transcription factors involved in T cell signalling pathway are the NFAT, NF-κB and AP1, a heterodimer of proteins Fos and Jun. All three transcription factors are needed to activate the transcription of interleukin-2(IL2) gene. [30]

NFAT Edit

NFAT activation depends on calcium signaling. IP3 produced by PLC-γ is no longer bound to the membrane and diffuses rapidly in the cell. Binding of IP3 to calcium channel receptors on the endoplasmic reticulum (ER) induces the release of calcium (Ca 2+ ) into the cytosol. The resulting low Ca 2+ concentration in the ER causes STIM1 clustering on the ER membrane, which in turn leads to activation of cell membrane CRAC channels that allows additional calcium to flow into the cytosol from the extracellular space. Therefore, levels of Ca 2+ are strongly increased in the T cell. This cytosolic calcium binds calmodulin, inducing a conformational change of the protein such that it can then bind and activate calcineurin. Calcineurin, in turn, dephosphorylates NFAT. In its deactivated state, NFAT cannot enter the nucleus as its nuclear localisation sequence (NLS) cannot be recognised by nuclear transporters due to phosphorylation by GSK-3. When dephosphorylated by Calcineurin translocation of NFAT into the nucleus is possible. [30] Additionally, there is evidence that PI-3K via signal molecules recruits the protein kinase AKT to the cell membrane. AKT is able to deactivate GSK3 and thereby inhibiting the phosphorylation of NFAT, which could contribute to NFAT activation. [36]

NF-κB Edit

NF-κB activation is initiated by DAG, the second, membrane bound product of PLCγ hydrolysation of PIP2. DAG binds and recruits Protein kinase C θ (PKCθ) to the membrane where it can activated the membrane bound scaffold protein CARMA1. CARMA1 then undergoes a conformational change which allow it to oligomerise and bind the adapter proteins BCL10, CARD domain and MALT1. This multisubunit complex binds the Ubiquitin ligase TRAF6. Ubiquitination of TRAF6 serves as scaffold to recruit NEMO, IκB kinase (IKK) and TAK1. [30] TAK 1 phosphorylates IKK, which in turn phosphorylates the NF-κB inhibitor I-κB, leading to the ubiquitination and subsequent degradation of I-κB. I-κB blocks the NLS of NF-κB therefore preventing its translocation to the nucleus. Once I-κB is degraded, it cannot bind to NF-κB and the NLS of NF-κB becomes accessible for nuclear translocation. [30]

AP1 Edit

Activation of AP1 involves three MAPK signalling pathways. These pathway use a phosphorylation cascade of three successive acting protein kinases to transmit a signal. The three MAPK pathways in T cells involve kinases of different specificities belonging to each of the MAP3K, MAP2K, MAPK families. Initial activation is done by the GTPase Ras or Rac which phosphorylate the MAP3K. [30] A cascade involving the enzymes Raf, MEK1, ERK results in the phosphorylation of Jun, conformational change allows Jun to bind to Fos and hence AP-1 to form. AP-1 then acts as transcription factor. Raf is activated via the second messenger DAG, SOS, and Ras. DAG recruits among other proteins the RAS guanyl nucleotide-releasing protein (RasGRP), a guanine nucleotide exchange factor (GEF), to the membrane. RasGRP activates the small GTPase Ras by exchanging Guanosine diphosphate (GDP) bound to Ras against Guanosine triphosphate (GTP). Ras can also be activated by the guanine nucleotide exchange factor SOS which binds to the LAT signalosom. Ras then initiates the MAPK cascade. [36] The second MAPK cascade with MEKK1, JNKK, JNK induces protein expression of Jun. Another cascade, also involving MEKK1 as MAPK3, but then activating MKK3 /6 and p38 induces Fos transcription. Activation of MEKK1, additionally to being activated by Ras, involves Slp-76 recruiting the GEF Vav to the LAT signalosom, which then activates the GTPase Rac. Rac and Ras activate MEKK1 and thereby initiate the MAPK cascade. [36]


Regenerative capacity and the developing immune system

Many components of the vertebrate immune system have evolved with dual, interrelated functions of both protecting injured tissues from infection and providing for tissue maintenance and repair of injuries. The capacity for organ regeneration, prominent among invertebrates and certain phylogenically primitive vertebrates, is poorly developed in mammals. We have proposed that evolution of the mammalian immune system has produced inflammatory cellular interactions at sites of injury which have optimized tissue defense and facilitated tissue repair, but that these improvements included concomitant loss of regenerative capacity. This chapter briefly reviews work in two regenerating systems: scar-free repair of fetal mammalian skin and regeneration of amputated limbs in larval frogs. In both organs the potential to regenerate anatomically and functionally complete new structures is lost gradually during ontogeny and this loss coincides with development of an immune system producing an inflammatory response in injured tissues. Failure of organ regeneration has long been associated with scarring or fibrosis and this phenomenon is a direct result of inflammatory interactions of immune cells and fibroblasts at sites of injury. Several aspects of immunity related to repair are reviewed, including the importance of antigen-presenting cells and lymphocytes, relevant cytokines and growth factors released by these and other cells, immune functions of extracellular matrix components, and immunological functions of fibroblasts. Skin repair in various transgenic mouse models has been especially informative. Further study of immune mechanisms associated with the loss of regenerative capacity in the skin and amphibian limb will be useful for efforts to promote mammalian organ regeneration.


شاهد الفيديو: الخلايا الليمفاوية (كانون الثاني 2022).